核酸序列的富集制造技术

本文提供了用于使用针对鉴别序列的引物从文库富集感兴趣的核酸序列的方法。随后可以克隆所述感兴趣的核酸序列，并且可以分析蛋白产物。产物。产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸序列的富集

技术介绍

[0001]样品可以出于各种目的而进行处理，诸如鉴别样品内的某种类型的部分。样品可以是生物样品。可以处理生物样品，诸如以便检测疾病(例如，癌症)或鉴别特定物类。处理样品的方法有多种，诸如聚合酶链反应(PCR)和测序。
[0002]可以在各种反应环境(诸如分区)内处理生物样品。分区可以是孔或液滴。可以采用液滴或孔以使生物样品能够被单独地分隔和处理的方式处理生物样品。例如，此类液滴可以与其他液滴流体地隔离，从而实现液滴中的相应环境的准确控制。
[0003]可以对分区中的生物样品进行各种过程，诸如化学过程或物理过程。可以对分区中的样品进行加热或冷却或化学反应，以便产生可以定性或定量处理的物类。可以在选择和富集反应中处理由生物样品产生的特定物类(例如，核酸)以更有效地回收感兴趣的核酸序列。

技术实现思路

[0004]本文提供了用于从多个核酸分子(诸如核酸分子的文库)富集感兴趣的核酸序列的方法。本文所提供的方法可以用于例如富集感兴趣的核酸序列，从而可以进一步克隆或分析该核酸序列。本文的方法可以提供低噪声、高特异性或两者兼有。在一些实施方案中，本文的方法可以用于感兴趣的核酸序列(例如，候选抗体)的选择或抗体发现应用。
[0005]本文提供了用于富集感兴趣的核酸序列的方法。在所述方法中，提供了具有多个鉴别序列的多个核酸分子。所述多个核酸分子中的核酸分子包含：(i)所述多个鉴别序列中的鉴别序列，该鉴别序列鉴别该核酸分子，并且包括条形码序列、模板转换寡核苷酸(TSO)序列和/或独特分子标识符(UMI)序列；以及(ii)感兴趣的核酸序列，其中感兴趣的核酸序列包括编码T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)或其片段的核酸序列。在第一轮扩增中使用与鉴别序列的至少一部分互补的第一核酸引物来扩增感兴趣的核酸序列。在第二轮扩增中使用与V(D)J序列的至少一部分互补的第二核酸引物来进一步扩增该核酸序列。
[0006]本文提供了用于富集感兴趣的核酸序列的方法，所述方法包括：(a)提供包含多个鉴别序列的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子中的核酸分子包含(i)所述多个鉴别序列中鉴别所述核酸分子的鉴别序列以及(ii)所述感兴趣的核酸序列；以及(b)使用与所述鉴别序列互补的核酸引物来扩增所述感兴趣的核酸序列，从而富集所述感兴趣的核酸序列。
[0007]在一些实施方案中，所述提供包括生成所述多个核酸分子，所述多个核酸分子包含鉴别所述多个核酸分子的所述多个鉴别序列
[0008]在一些实施方案中，所述多个核酸分子对应于来自所述多个细胞的多个细胞表面蛋白。在一些实施方案中，所述多个细胞包括多个T细胞。在一些实施方案中，所述多个细胞表面蛋白包括多个T细胞受体。在一些实施方案中，所述多个细胞包括多个B细胞。在一些实施方案中，所述多个细胞表面蛋白包括多个B细胞受体。
[0009]在一些实施方案中，所述多个核酸分子包含编码氨基酸序列的多个变体的核酸分
子的文库。在一些实施方案中，所述氨基酸序列的所述多个变体是T细胞受体的变体。在一些实施方案中，所述氨基酸序列的所述多个变体是抗体或其抗原结合片段的变体。在一些实施方案中，所述多个核酸分子包含互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子。在一些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列包含编码T细胞受体或其片段的核酸序列。在一些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列。在一些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列包含编码V(D)J序列的核酸序列。
[0010]在一些实施方案中，所述鉴别序列包含条形码序列。在一些实施方案中，与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述条形码序列的至少一部分互补。在一些实施方案中，与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述条形码序列和所述感兴趣的核酸序列的读段序列互补。在一些实施方案中，所述鉴别序列包含模板转换寡核苷酸序列。在一些实施方案中，与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述模板转换寡核苷酸序列的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述鉴别序列包含独特分子标识符序列。在一些实施方案中，与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述独特分子标识符序列的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述核酸引物还包含与所述编码序列的一部分互补的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸引物还包含与所述V(D)J序列的至少一部分互补的核酸序列。在一些实施方案中，与所述V(D)J序列的至少一部分互补的所述核酸序列与所述V(D)J序列的V序列互补。在一些实施方案中，所述核酸引物还包含非结合柄。
[0011]一些实施方案还包括使用另一个核酸引物扩增所述感兴趣的核酸序列，其中所述另一个核酸引物不同于所述核酸引物。在一些实施方案中，所述另一个核酸引物包含非结合柄。在一些实施方案中，所述核酸引物和所述另一个核酸引物被构造为退火至位于所述感兴趣的核酸序列的至少一部分的旁侧的序列。
[0012]一些实施方案还包括聚合酶链反应，从而进一步富集所述多个核酸分子的所述核酸序列。
[0013]在一些实施方案中，不扩增所述多个核酸分子中的其他核酸分子。在一些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列被富集至少1000倍、至少10,000倍或至少100,000倍。
[0014]一些实施方案还包括使所述多个核酸序列与第二核酸引物接触，其中所述核酸引物包含与所述感兴趣的核酸序列的互补序列上的结合序列互补的核酸序列。在一些实施方案中，所述第二核酸引物还包含非结合柄。在一些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列包括编码抗体或其抗原结合片段的序列。在一些实施方案中，所述第二核酸引物与编码所述抗体或其抗原结合片段的V(D)J序列的核酸序列的互补序列的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述第二核酸引物与编码所述抗体或其抗原结合片段的恒定区的核酸序列的互补序列的至少一部分互补。在一些实施方案中，所述第二核酸引物还与编码所述抗体或其抗原结合片段的J区的核酸序列的互补序列的至少一部分互补。
[0015]一些实施方案还包括将所述感兴趣的核酸序列克隆进载体中。在一些实施方案中，所述载体选自由病毒载体、质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体组成的组。在一些实施方案中，所述克隆包括组合两个或更多个核酸序列。在一些实施方案中，所述两个或更多个核酸序列包含抗体或抗原结合片段的重链的核酸序列和轻链的核酸序列。在一些实施方案中，所述两个或更多个核酸序列包含T细胞受体的α链的核酸序列和T细胞受体的β链的核酸序列。在一些实施方案中，所述载体包含T细胞受体的恒定区的至少一部分。在一些实施方案
中，所述载体包含抗体或其抗原结合片段的恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，所述载体包含启动子。
[0016]一些实施方案还包括确定所述感兴趣的核酸序列的富集水平。一些实施方案还包括执行第二轮扩增以进一步富集所述感兴趣的核酸序列。一些此类实施方案包括使所述感兴趣的核酸序列与第三引物和第四引物接触。在一些实施方案中，所述第三引物与所述鉴别序列的条形码的一部分互补。在一些实施方案中，所述第三引物与所述鉴别序列的所述条形码的5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于富集感兴趣的核酸序列的方法，包括：(a)提供包含多个鉴别序列的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子中的核酸分子包含：(i)所述多个鉴别序列中鉴别所述核酸分子的鉴别序列，其中所述鉴别序列包含条形码序列、模板转换寡核苷酸(TSO)序列和/或独特分子标识符(UMI)序列；以及(ii)所述感兴趣的核酸序列，其中所述感兴趣的核酸序列包含编码T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)或其片段的核酸序列；(b)在第一轮扩增中使用与所述鉴别序列的至少一部分互补的第一核酸引物来扩增所述感兴趣的核酸序列；(c)在第二轮扩增中使用与V(D)J序列的至少一部分互补的第二核酸引物来进一步扩增所述感兴趣的核酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述鉴别序列包含所述条形码序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴别序列包含所述UMI序列。4.根据权利要求1或权利要求3所述的方法，其中所述第一核酸引物包含与所述UMI序列的至少一部分互补的序列。5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一核酸引物包含与所述条形码序列的至少一部分互补的序列。6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一轮扩增还包括使用第三引物，所述第三引物包含与编码所述TCR、BCR或其片段的恒定区的核酸序列的互补序列的至少一部分互补的序列。7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一轮扩增还包括使用第三引物，所述第三引物包含与编码所述BCR或其片段的恒定区的核酸序列的互补序列的至少一部分互补的序列。8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二轮扩增还包括使用第四引物，所述第四引物包含与编码所述V(D)J序列下游的序列的核酸序列的互补序列的至少一部分互补的序列。9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中第二引物包含非结合柄。10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述第四引物包含非结合柄。11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述多个所提供的核酸分子包含互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子。12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述感兴趣的核酸序列编码所述BCR或其片段。13.一种用于富集感兴趣的核酸序列的方法，包括：(a)提供包含多个鉴别序列的多个核酸分子，其中所述多个核酸分子中的核酸分子包含(i)所述多个鉴别序列中鉴别所述核酸分子的鉴别序列以及(ii)所述感兴趣的核酸序列；以及(b)使用与所述鉴别序列互补的核酸引物来扩增所述感兴趣的核酸序列，从而富集所
述感兴趣的核酸序列。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述提供包括生成所述多个核酸分子，所述多个核酸分子包含鉴别所述多个核酸分子的所述多个鉴别序列。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述多个核酸分子对应于来自所述多个细胞的多个细胞表面蛋白。16.根据权利要求13所述的方法，其中所述多个细胞包括多个T细胞。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述多个细胞表面蛋白包括多个T细胞受体。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述多个细胞包括多个B细胞。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述多个细胞表面蛋白包括多个B细胞受体。20.根据权利要求13所述的方法，其中所述多个核酸分子包含编码氨基酸序列的多个变体的核酸分子的文库。21.根据权利要求13所述的方法，其中所述氨基酸序列的所述多个变体是T细胞受体的变体。22.根据权利要求13所述的方法，其中所述氨基酸序列的所述多个变体是抗体或其抗原结合片段的变体。23.根据权利要求13所述的方法，其中所述多个核酸分子包含互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子。24.根据权利要求13所述的方法，其中所述感兴趣的核酸序列包含编码T细胞受体或其片段的核酸序列。25.根据权利要求13所述的方法，其中所述感兴趣的核酸序列包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列。26.根据权利要求13或权利要求25所述的方法，其中所述感兴趣的核酸序列包含编码V(D)J序列的核酸序列。27.根据权利要求13所述的方法，其中所述鉴别序列包含条形码序列。28.根据权利要求27所述的方法，其中与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述条形码序列的至少一部分互补。29.根据权利要求27所述的方法，其中与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述条形码序列和所述感兴趣的核酸序列的读段序列互补。30.根据权利要求13所述的方法，其中所述鉴别序列包含模板转换寡核苷酸序列。31.根据权利要求30所述的方法，其中与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述模板转换寡核苷酸序列的至少一部分互补。32.根据权利要求13所述的方法，其中所述鉴别序列包含独特分子标识符序列。33.根据权利要求32所述的方法，其中与所述鉴别序列互补的所述核酸序列与所述独特分子标识符序列的至少一部分互补。34.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸引物还包含与所述编码序列的一部分互补的核酸序列。35.根据权利要求26所述的方法，其中所述核酸引物还包含与所述V(D)J序列的至少一部分互补的核酸序列。36.根据权利要求35所述的方法，其中与所述V(D)J序列的至少一部分互补的所述核酸
序列与所述V(D)J序列的V序列互补。37.根据权利要求13所述的方法，其中述核酸引物还包含非结合柄。38.根据权利要求13或权利要求37所述的方法，还包括使用另一个核酸引物扩增所述感兴趣的核酸序列，其中所述另一个核酸引物不同于所述核酸引物。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述另一个核酸引物包含非结合柄。40.根据权利要求38所述的方法，其中所述核酸引物和所述另一个核酸引物被构造为退火至位于所述感兴趣的核酸序列的至少一部分的旁侧的序列。41.根据权利要求13所述的方法，还包括聚合酶链反应，从而进一步富集所述多个核酸分子的所述核酸序列。42.根据权利要求13所述的方法，其中不扩增所述多个核酸分子中的其他核酸分子。43.根据权利要求13所述的方法，其中所述感兴趣的核酸序列被富集至少1000倍、至少10,000倍或至少100,000倍。44.根据权利要求13所述的方法，还包括使所述多个核酸序列与第二核酸引物接触，其中所述核酸引物包含与所述感兴趣的核酸序列的互补序列上的结合序列互补的核酸序列。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述第二核酸引物还包含非结合柄。46.根据权利要求44所述的方法，其中所述感兴趣的核酸序列包含编码抗体或其抗原结合片段的序列。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第二核酸引物与编码所述抗体或其抗原结合片段的V(D)J序列的核酸序列的互补序列的至少一部分互补。48.根据权利要求46所述的方法，其中所述第二核酸引物与编码所述抗体或其抗原结合片段的恒定区的核酸序列的互补序列的至少一部分互补。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第二核酸引物还与编码所述抗体或其抗原结合片段的J区的核酸序列的互补序列的至少一部分互补。50.根据权利要求13所述的方法，还包括将所述感兴趣的核酸序列克隆进载体中。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述载体选自由病毒载体、质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体组成的组。52.根据权利要求50所述的方法，其中所述克隆包括组合两个或更多个核酸序列。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述两个或更多个核酸序列包含抗体或抗原结合片段的重链的核酸序列和轻链的核酸序列。54.根据权利要求52所述的方法，其中所述两个或更多个核酸序列包含T细胞受体的α链的核酸序列和T细胞受体的β链的核酸序列。55.根据权利要求50所述的方法，其中所述载体包含T细胞受体的恒定区的至少一部分。56.根据权利要求50所述的方法，其中所述载体包含抗体或其抗原结合片段的恒定区的至少一部分。57.根据权利要求50所述的方法，其中所述载体包含启动子。58.根据权利要求13所述的方法，还包括确定所述感兴趣的核酸序列的富集水平。59.根据权利要求58所述的方法，还包括执行第二轮扩增以进一步富集所述感兴趣的核酸序列。
60.根据权利要求59所述的方法，包括使所述感兴趣的核酸序列与第三引物和第四引物接触。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述第三引物与所述鉴别序列的条形码的一部分互补。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述第三引物与所述鉴别序列的所述条形码的5
’
端互补。63.根据权利要求62所述的方法，其中所述第三引物还与读段序列互补。64.根据权利要求60所述的方法，其中所述第三引物与所述鉴别序列的条形码上游的所述鉴别序列的一部分互补。65.根据权利要求60所述的方法，其中所述第四引物与所述感兴趣的核酸序列的恒定区的所述互补序列的至少一部分互补。66.根据权利要求13所述的方法，还包括执行所述感兴趣的核酸序列的片段化。67.根据权利要求13所述的方法，还包括对所述感兴趣的核酸序列加A尾。68.根据权利要求13所述的方法，还包括对所述感兴趣的核酸序列执行SI
‑
PCR。69.根据权利要求13所述的方法，还包括所述感兴趣的核酸序列的V(D)J富集。70.根据权利要求13所述的方法，其中所述感兴趣的核酸序列包含限制性位点。71.一种方法，包括：至少基于感兴趣的核酸序列的恒定区的至少一部分来富集所述感兴趣的核酸序列，从而产生富集的感兴趣的核酸序列；以及修饰所述富集的核酸序列，从而产生与载体相容...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：一零X基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：