基于链置换扩增和引物交换反应无标记检测miR-21的荧光生物传感器制造技术

本文公开了一种基于链置换扩增(SDA)和引物交换反应(PER)级联扩增的方法用于miR

【技术实现步骤摘要】
基于链置换扩增和引物交换反应无标记检测miR
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21的荧光生物传感器


[0001]本专利技术属于生物化学分析方法，具体涉及一种基于链置换扩增和引物交换反应级联扩增的无标记检测miR
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21的荧光生物传感器。
[0002]MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性小RNA分子，参与转录后基因表达调控，miRNAs的异常表达与人类癌症的发生、肿瘤分期和肿瘤治疗密切有关。因此，miRNAs被认为是一种潜在的生物标志物，定量分析miRNAs的表达能够更好地了解它们在癌症中的作用，从而实现对癌症的早期诊断和抗癌靶向药物的研发。然而，由于miRNAs家族成员间序列高度同源及其在总RNA样本中低丰度，易降解等特点，使得它们的检测十分困难。目前常用的检测miRNAs的方法主要有实时聚合酶链反应(qPCR)、微阵列和Northern印迹。这些方法虽然能够有效检测到miRNAs，但也存在一定的局限性，如引物设计复杂和成本较高等。越来越多的检测方法采用等温扩增方法取代传统的检测方法，已开发的等温扩增技术常存在灵敏度不理想、核酸序列设计复杂、操作繁琐等不足，而链置换扩增(SDA)和引物交换反应(PER)均只需要一个模板和一条引物，体系简单。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术将靶标识别、链置换扩增(SDA)和引物交换反应(PER)级联信号放大均在恒温条件下同时进行，提供了一种既操作简便又可灵敏检测miR
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21的荧光生物传感器。主要由4部分组成：
[0004](1)miR
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21特异性识别模板H1；
[0005](2)在BstDNA聚合酶作用下向前延伸，Nb.BbvCI内切酶在特定位点识别切割，不断聚合切割，产生大量单链DNA
[0006](3)产生的单链DNA作为引物触发引物交换反应(PER)，形成级联扩增模式，产生大量不同长度G
‑
四链体片段；
[0007](4)硫磺素T(ThT)染料嵌入大量不同长度G
‑
四链体片段中，产生强荧光信号；
[0008]所述模板H2的3
’
末端修饰有倒置的T，防止非特异性扩增；H2中间位置的CG碱基对还进行了羟甲基化修饰，作为终止位点，所述H1与靶标miR
‑
2结合后经过聚合切割产生的单链DNA优选为21个碱基。
[0009]进一步的，所述模板H1优选为43个碱基，所述模板H2优选为34个碱基。
[0010]本专利技术的检测原理如图1所示。miR
‑
21通过碱基互补配对的原理与发夹模板H1结合，并在Bst聚合酶和dNTPs的帮助下延伸成双链(dsDNA)，Nb.BbvCI特异性识别并切割dsDNA，暴露3
’
羟基末端。在聚合酶的作用下，DNA继续向前复制。经过多次聚合切割后，获得大量单链DNA，这些DNA与H2上的引物结合结构域互补杂交，在聚合酶的帮助下向前复制，并停止在停止位点。发夹H2中的序列结构域与扩展产物竞争，扩展产物被释放。释放的延伸产物与引物DNA碱基具有相同的组成，因此延伸的DNA可以反过来充当引物来触发下一轮引物交换反应(PER)。这些不同长度的ssDNA富含大量的G碱基，在钾离子环境中折叠成G
‑
四链体
结构。随着ThT的添加，G4/ThT复合物产生显著的荧光信号。
[0011]优选的，所述的靶标触发的链置换扩增(SDA)和引物交换反应(PER)级联扩增检测miR
‑
21的方法包括如下步骤：
[0012](1)用1*TE缓冲液将模板H1和模板H2退火，退火反应条件优选为95℃5min变性，缓慢降温至25℃后恒温反应60min。
[0013](2)把4μL待测样品加入反应溶液I中，进行miR
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21识别以及级联扩增反应，产生大量不同长度G
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四链体片段，然后高温灭活处理。miR
‑
21识别以及级联扩增反应的条件优选为25
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45℃(优选为37℃)，反应60
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120min(优选为90min)，高温灭活的温度优选为80℃，反应10
‑
20min(优选为20min)。
[0014](3)用K
+
缓冲液将步骤(2)反应后的溶液稀释至100μL，向其中加入ThT染料，避光孵育后测荧光，荧光激发波长425nm，在发射波长497nm处测得荧光强度值，代入公式F＝34.17LgC
miR
‑
21
+271.02，计算可得样品中所含miR
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21的量；避光孵育的条件优选为25
‑
45℃(优选为37℃)避光孵育10
‑
30min(优选为30min)。
[0015]所述步骤(1)中模板H1和模板H2分别为75nM、150nM。
[0016]所述步骤(2)中，反应溶液I中包括步骤(1)中所制模板H1(75nM)、模板H2(150nM)、Nb.BbvCI内切酶(0.25U/μL)、BstDNA聚合酶(1U/μL)、反应buffer和水，构成40μL的反应体系。
[0017]所述步骤(3)中，加入4μLThT染料。
[0018]本专利技术的优点在于：(1)本专利技术将靶标识别、链置换扩增(SDA)和引物交换反应(PER)级联扩增及信号放大均在恒温条件下同时进行，操作简便又快速，90min即可实现miR
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21的定量检测，且不需要多种复杂的仪器设备。(2)本专利技术用到的DNA均为无荧光标记的DNA，在扩增产物中加入ThT染料进行定量检测。不仅避免了背景荧光信号的干扰，而且大大降低了检测成本。(3)本专利技术仅用微量样本(4μL)即可完成miR
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21定量检测。(4)本专利技术适用于复杂样品中miR
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21的检测，包括血液、以及细胞提取液。
附图说明
[0019]图1是本专利技术利用链置换扩增(SDA)和引物交换反应(PER)级联扩增反应灵敏检测miR
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21的的工作原理图。
[0020]图2为验证实验原理可行性的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0021]图3为验证实验原理可行性的荧光光谱图。
[0022]图4为对反应过程中模板H1浓度(A)、模板H2浓度(B)、BstDNA聚合酶浓度(C)、Nb.BbvCI内切酶浓度(D)、ThT浓度(E)以及反应时间(F)的优化。
[0023]图5是不同浓度miR
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21检测的荧光光谱图。
[0024]图6是荧光强度与miR
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21浓度的对数值之间的线性关系图。
[0025]图7是本专利技术的特异性分析。
[0026]图8是本专利技术的重复性分析。
[0027]图9是本专利技术对实际样品分析。
具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于链置换扩增和引物交换反应无标记检测miR
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21的荧光生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括链置换扩增(SDA)模板H1、引物交换反应(PER)模板H2、miR
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21、Bst DNA聚合酶、Nb.BbvCI内切酶和硫磺素T(ThT)。2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述模板H2的3
’
末端修饰有倒置的T，防止非特异性扩增；H2中间位置的CG碱基对还进行了羟甲基化修饰，作为终止位点。3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器还包括dNTPs，所述dNTPs由四种去氧核苷酸三磷酸即dATP、dCTP、dGTP和dTTP按等比例混合而组成。4.一种检测miR
‑
21的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1
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3任一项所述生物传感器进行检测。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：S1、用含Mg
2+
的1*TE缓冲液将SDA模板H1和PER模板H2退火形成发夹；S2、把待测样品加入反应溶液I中，进行miR
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21识别以及链置换扩增(SDA)和引物交换反应(PER)级联扩增反应，产生大量G
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四链体片段，然后高温灭活处理；S3、向步骤S2反应后的溶液中加入ThT染料，得到嵌入ThT的大量G
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四链体...

【专利技术属性】
技术研发人员：向华，杜昱旻，祁银肖，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：