一种核酸扩增方法技术

本发明专利技术公开一种核酸扩增方法。与现有技术相比，本发明专利技术的扩增方法利用封闭扩增的方法抑制了引物二聚体的产生及飘散，保护了未杂交上模板的空的微反应室，使空微反应室免受引物二聚体的污染，可以进行后续的文库杂交，多次文库杂交使得单克隆率明显提升，提高了芯片的测序通量。序通量。序通量。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸扩增方法


[0001]本专利技术涉及一种核酸扩增方法，属于分子生物学领域。

技术介绍

[0002]现阶段高通量测序技术发展迅速，已成为目前生命科学领域、医学领域的常用检测方法，它具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低的特点。测序化学反应通常在流动池(或反应室)内发生，流动池内固定有扩增引物，在流动池中引入待测核酸和其他试剂。这种技术需要DNA文库中的单个核酸模板在芯片的微反应室中进行扩增放大信号，从而实现同时检测几十万到几百万个DNA分子的目的，为了制备足量的模板，通常需要在模板末端连接衔接子序列(adaptor)，这些衔接子序列被设计成与固定在流动池内的扩增引物序列杂交，然后将模板扩增，从而产生相同模板链的簇。理想情况下，这些簇为单克隆簇，具有相似的大小并且与其他簇间隔开，以在成像时可以达到准确的分辨率。为此，高通量测序技术需要将文库均匀杂交到带有微反应室(例如，微坑、微阱、微孔等)的芯片表面，而DNA文库进入到微坑的数量符合泊松分布。目前，在高通量测序领域中较为简单的是泊松扩增，即一定浓度的DNA文库分子随机杂交到芯片的微坑中，在控制文库浓度的条件下，使泊松分布的λ为1时(最高单克隆率)，36％的微坑中有1个DNA分子，36％的微坑中没有DNA分子，28％的微坑中有2个及2个以上的DNA分子。在后续的扩增过程中，微坑中的多个分子会同时扩增，产生多克隆，严重影响测序的准确度，而部分微坑内没有DNA分子进入，则极大浪费了芯片通量。
[0003]超泊松扩增技术是指待测DNA文库杂交到微坑芯片上后能够有超过36％的微坑经扩增后产生单克隆。这种扩增方式提高了芯片上的微坑的利用率，一张芯片可以产出更多的数据。需要开发一种适用于高通量测序的超泊松扩增方法，以提高测序通量。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：
[0005](A).提供固相载体，所述固相载体包括多个微反应室，所述微反应室内附接扩增引物；
[0006](B).将包含模板多核苷酸的文库与所述固相载体接触，允许模板多核苷酸的单链与所述扩增引物杂交，从而将模板多核苷酸固定在微反应室内；
[0007](C).向固相载体表面提供扩增反应试剂，扩增反应试剂进入微反应室内，再提供封闭材料或封闭条件将微反应室封闭，形成相互隔离的反应单元；
[0008](D).在合适的条件下进行扩增反应，在部分微反应室中形成单个模板多核苷酸的扩增子的单克隆群体；
[0009](E).重复步骤(B)、(C)和(D)至少一次。
[0010]根据优选的实施方式，封闭材料包括油相流体或稀有气体，所述油相流体选自电子氟化液或矿物油等。
[0011]根据优选的实施方式，步骤(C)的扩增反应试剂包含在具有缓释功能的温敏水凝
胶内，在低温下将温敏水凝胶通入固相载体内，再升高温度使水凝胶转变为凝胶态，从而将微反应室封闭。
[0012]根据优选的实施方式，扩增方法还包括步骤(F)，向固相载体表面提供扩增反应试剂，进行扩增以扩大所述单个模板多核苷酸的扩增子的单克隆群体。
[0013]根据优选的实施方式，重复步骤(B)、(C)和(D)两次。
[0014]根据优选的实施方式，扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、切刻内切酶恒温扩增(NEAR)、滚环扩增(RCA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式扩增或PCR等扩增方式中的一种。
[0015]根据优选的实施方式，在步骤(D)之后包含清除步骤，去除封闭材料以及反应试剂。
[0016]根据优选的实施方式，步骤(B)的重复利用与步骤(B)中所用的相同的包含模板多核苷酸的文库进行，步骤(B)的重复与步骤(B)中的文库的浓度之比为0.1～1的任意数值，优选的为1。
[0017]根据优选的实施方式，固相载体是惰性基底或基质，惰性基底或基质的材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅、光纤或光纤束、树脂、陶瓷、金属、硝化纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯。
[0018]根据优选的实施方式，固相载体包括惰性基底或基质以及媒介材料，媒介材料直接附接扩增引物，并通过共价作用力或非共价作用力连接至惰性基底或基质；媒介材料包括但不限于水凝胶层、水凝胶微球、磁性微球。
[0019]本专利技术提供一种基因测序方法，其特征在于，将按照前述任一项所述的扩增方法得到的扩增产物变为单链后，向固体载体表面提供测序反应试剂，进行测序反应。
[0020]根据优选的实施方式，扩增引物包含剪切位点，提供剪切试剂作用于剪切位点后，将扩增产物剪切为单链。
[0021]根据优选的实施方式，所述测序包括荧光发生测序。
[0022]本专利技术的有益效果
[0023]与现有技术相比，本专利技术的扩增方法具有明显优势，利用封闭扩增的方法抑制了引物二聚体的产生及飘散，保护了未杂交上模板的空的微反应室，使空微反应室免受引物二聚体的污染，可以进行后续的文库杂交，多次文库杂交使得单克隆率明显提升，提高了芯片的测序通量。
附图说明
[0024]图1.计算机模拟的不同文库杂交次数对应的单克隆率的结果，其中，横坐标指示芯片扩增率，纵坐标指示单克隆率。
[0025]图2.本申请实施方式对芯片局部进行荧光淬灭后不同时间的芯片荧光图。
[0026]图3.本申请实施方式中封闭扩增以及不封闭扩增下的芯片中引物二聚体的分布照片。
[0027]图4.本申请实施方式中油封芯片后的全芯片照片，芯片照片上高亮区域为残水区域，较暗区域为油封良好区域。
[0028]图5.本申请实施方式超泊松扩增得到的产物和普通扩增得到产物的单克隆率结果分析图，图中每一个小格子代表芯片中一个tile的单克隆率，分别计算整张芯片的所有tile的单克隆率，再按照每个tile在芯片中的位置将其结果汇集，颜色越白代表单克隆率越高。
具体实施方式
[0029]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术，而非对本专利技术的限制。附图中各部分的尺寸和形状不代表真实比例，只用以示意本
技术实现思路
。
[0030]除非另外定义，否则本文使用的所有科学和技术术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
[0031]术语解释
[0032]固相载体
[0033]本专利技术中，固相载体指的是核酸分子可以附接于其上的任何不可溶的惰性基底或基质，例如玻璃、硅(例如硅晶片)、陶瓷、树脂、二氧化硅、二氧化硅基材料、塑料、尼龙、硝化纤维素、金属、光纤或光纤束、聚乙烯、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、丙烯酸、聚丁烯、聚氨酯、乳胶珠、葡聚糖珠和多孔板等。表面的形状是可选择的，包括，例如的，适合用于特定应用的多孔的、平面的或球形的。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：(A).提供固相载体，所述固相载体包括多个微反应室，所述微反应室内附接扩增引物；(B).将包含模板多核苷酸的文库与所述固相载体接触，允许模板多核苷酸的单链与所述扩增引物杂交，从而将模板多核苷酸固定在微反应室内；(C).向固相载体表面提供扩增反应试剂，扩增反应试剂进入微反应室内，再提供封闭材料或封闭条件将微反应室封闭，形成相互隔离的反应单元；(D).在合适的条件下进行扩增反应，在部分微反应室中形成单个模板多核苷酸的扩增子的单克隆群体；(E).重复步骤(B)、(C)和(D)至少一次。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述封闭材料包括油相流体或稀有气体，所述油相流体选自电子氟化液或矿物油。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(C)所述的扩增反应试剂包含在具有缓释功能的温敏水凝胶内，在低温下将温敏水凝胶通入固相载体内，再升高温度使水凝胶转变为凝胶态，从而将微反应室封闭。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(F)，向固相载体表面提供扩增反应试剂，进行扩增以扩大所述单个模板多核苷酸的扩增子的单克隆群体。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，重复步骤(B)、(C)和(D)两次。6.根据权利要求1
‑
3，5任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增是环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈晨，乔朔，康力，吴思彧，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：