一种芯片表面的扩增方法技术

本发明专利技术提供了一种芯片表面的扩增方法，在第一扩增阶段，只向芯片表面提供一种固相扩增引物，通过重组酶聚合酶扩增来实现模板链的线性增长。在第二扩增阶段再向芯片上引入另外的固相引物，进行指数扩增，规避聚合酶自身的低保真度，降低扩增产物的错误概率，从而提高测序准确度。序准确度。序准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种芯片表面的扩增方法


[0001]本专利技术涉及一种芯片表面的扩增方法及测序方法，属于基因测序领域。

技术介绍

[0002]现阶段高通量测序技术发展迅速，已成为目前生命研究的常用的分析方法，它具有通量高、检测速度快、灵活多用、成本低的特点，这种技术需要通过扩增将目的DNA指数性的放大，从而实现同时检测几十万到几百万的DNA分子的目的，因此一种测序技术对应一种扩增方式。目前，在高通量测序领域中使用的较为广泛的是指数型扩增方式，如桥式PCR，重组酶聚合酶扩增(RPA)等。由于指数型扩增方法中普遍使用的聚合酶保真度较低，在生成初始的模板DNA互补链时有一定概率发生了错误，在后续的扩增过程中初始的错误会被继承下去，后续的扩增产物都带有这个错误，从而导致扩增产物序列与文库模板序列的差异，最终导致测序结果的错误。
[0003]为了降低测序结果的错误率，需要从根本上降低扩增过程中出现的错误。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供了一种新的扩增方法：在第一扩增阶段，只向芯片表面提供一种固相扩增引物，通过重组酶聚合酶扩增来实现模板链的线性增长。在第二扩增阶段再向芯片上引入另外的固相引物，进行指数扩增，这样可以规避聚合酶自身的低保真度，降低扩增产物的错误概率，从而提高测序准确度。
[0005]具体的，本专利技术公开一种芯片表面的扩增方法，其特征在于，包括：
[0006](1)在芯片表面固定多个第一扩增寡核苷酸；
[0007](2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与所述第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸的至少部分序列是互补配对的；
[0008](3)加入扩增试剂，进行芯片表面扩增，生成固定在芯片表面的单链多核苷酸及双链多核苷酸；所述扩增试剂包含重组酶、聚合酶；
[0009](4)在芯片表面固定多个第二扩增寡核苷酸；所述第二扩增寡核苷酸与所述接头序列2至少部分序列是相同的；
[0010](5)加入扩增试剂，进行芯片表面扩增，生成固定在芯片表面的多个双链多核苷酸。
[0011]根据优选的实施方式，步骤(4)还包括，在芯片表面固定多个第三扩增寡核苷酸，第三扩增寡核苷酸包含第一扩增寡核苷酸的3
’
端完整序列，且第三扩增寡核苷酸的3
’
端包含额外碱基，额外碱基与单链模板多核苷酸对应位置的碱基相同或互补配对。
[0012]根据优选的实施方式，第三扩增寡核苷酸包含第一扩增寡核苷酸的3
’
端完整序列，此部分序列占第一扩增寡核苷酸全长的比例为60％以上，优选的，占比为70％以上，更优选的，占比为80％以上，更优选的，占比为90％以上。
[0013]根据优选的实施方式，第三扩增寡核苷酸包含第一扩增寡核苷酸的完整序列。
[0014]根据优选的实施方式，第三扩增寡核苷酸3
’
端包含的额外碱基的数目为1
‑
10个，更优选为1
‑
5个，例如的，额外碱基可以是1个，或2个，或3个，或4个，或5个，或6个，或7个，或8个，或9个，或10个。
[0015]根据优选的实施方式，第二扩增寡核苷酸与第三扩增寡核苷酸的数量比为0.1
‑
10之间的任意数，优选为0.5
‑
2之间的任意数。
[0016]根据优选的实施方式，步骤(5)中的扩增是重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式PCR等扩增方式中的一种。
[0017]根据优选的实施方式，前述扩增优选的为恒温扩增，是重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)中的一种。
[0018]根据优选的实施方式，前述恒温扩增的温度为低于70℃，优选的，低于50℃。例如的，低于42℃。
[0019]根据优选的实施方式，芯片表面具备离散分布的凹陷结构，为发生反应的微反应室，微反应室内固定DNA载体，DNA载体固定扩增寡核苷酸。
[0020]根据优选的实施方式，芯片表面的微反应室，形状是圆柱形、圆台形、凹槽、类圆台形、六边形、三角形、类六方柱结构，或者其组合。
[0021]根据优选的实施方式，DNA载体是小的离散颗粒，合适的成分包括但不限于：塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、二氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联的葡聚糖、纤维素、尼龙、交联的胶束和Teflon等。例如的，DNA载体可以是水凝胶微球或者PEG胶等，通过共价作用力或非共价作用力固定于微反应室内。
[0022]根据优选的实施方式，DNA载体表面修饰有特定化学基团，选自氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、生物素，环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等，扩增寡核苷酸通过共价作用力连接到DNA载体的附着点上，扩增寡核苷酸的5
’
端修饰的基团通过与DNA载体表面化学基团发生反应固定在DNA载体表面，所述基团可选自氨基、羧基、环氧基、羟基、醛基、叠氮基、炔基、环炔基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巯基等。
[0023]根据优选的实施方式，DNA载体包含多个附着点，最多一半的附着点由第一扩增寡核苷酸占据。
[0024]根据优选的实施方式，步骤(4)将第二扩增寡核苷酸固定到剩余的可用附着点上，或者将第二扩增寡核苷酸和第三扩增寡核苷酸固定到剩余的可用附着点上。
[0025]本专利技术的另一方面公开了一种芯片表面的测序方法，其特征在于，包括：
[0026](1)在芯片表面固定多个第一扩增寡核苷酸；
[0027](2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与所述第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸的至少部分序列是互补配对的；
[0028](3)加入扩增试剂，进行芯片表面扩增，生成固定在芯片表面的单链多核苷酸及双链多核苷酸；所述扩增试剂包含重组酶、聚合酶；
[0029](4)在芯片表面固定多个第二扩增寡核苷酸；所述第二扩增寡核苷酸与所述接头
序列2至少部分序列是相同的；
[0030](5)加入扩增试剂，进行芯片表面扩增，生成固定在芯片表面的多个双链多核苷酸；
[0031](6)选择性去除所述双链多核苷酸中的第二模板链，以允许第一模板链与测序引物杂交；
[0032](7)杂交测序引物，对所述第一模板链测序。
[0033]根据优选的实施方式，步骤(4)还包括，在芯片表面固定多个第三扩增寡核苷酸，所述第三扩增寡核苷酸包含所述第一扩增寡核苷酸的3
’
端完整序列，且所述第三扩增寡核苷酸的3
’
端包含额外碱基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芯片表面的扩增方法，其特征在于，包括：(1)在芯片表面固定多个第一扩增寡核苷酸；(2)提供单链模板多核苷酸，将所述单链模板多核苷酸与所述第一扩增寡核苷酸杂交；所述的单链模板多核苷酸两端含有公共接头序列，即接头序列1和接头序列2，其中，接头序列1和第一扩增寡核苷酸的至少部分序列是互补配对的；(3)加入扩增试剂，进行芯片表面扩增，生成固定在芯片表面的单链多核苷酸及双链多核苷酸；所述扩增试剂包含重组酶、聚合酶；(4)在芯片表面固定多个第二扩增寡核苷酸；所述第二扩增寡核苷酸与所述接头序列2至少部分序列是相同的；(5)加入扩增试剂，进行芯片表面扩增，生成固定在芯片表面的多个双链多核苷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)还包括，在芯片表面固定多个第三扩增寡核苷酸，所述第三扩增寡核苷酸包含所述第一扩增寡核苷酸的3
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端完整序列，且所述第三扩增寡核苷酸的3
’
端包含额外碱基，所述额外碱基与单链模板多核苷酸对应位置的碱基相同或互补配对。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一扩增寡核苷酸的3
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端完整序列占第一扩增寡核苷酸全长的60％～100％。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述额外碱基的数目为1
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10个，更优选为1
‑
5个。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二扩增寡核苷酸与所述第三扩增寡核苷酸的数量比为0.1
‑
10之间的任意数，优选为0.5
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2之间的任意数。6.根据权利要求1
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5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的扩增是重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、桥式PCR等扩增方式中的一种。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增优选的为恒温扩增，所述恒温扩增的温度为低于70℃，优选的，低于50℃。8.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：石磊，周文雄，李艳秋，王晓洁，沈晨，康力，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：