分离丙型肝炎病毒肽的方法技术

描述了一种方法，用于分离具有结合ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的能力的丙型肝炎病毒肽（ＨＰ），或一种含有该ＨＣＶ肽与该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的复合物，该方法的特征在于下列步骤：提供一个ＨＣＶ肽库，该库含有可与该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子结合的ＨＣＶ肽和不与该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子结合的ＨＣＶ肽；使该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子接触该ＨＣＶ肽库，从而使具有结合该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的能力的ＨＣＶ肽与该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子结合，形成含有该ＨＣＶ肽和该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的复合物；检测该复合物，任选地使其与不结合该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的ＨＣＶ肽分离；任选地从该复合物中分离并表征该ＨＣＶ肽。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2003年8月27日、申请号为03809696.X、专利技术 名称为"分离丙型肝炎病毒的方法"的专利技术专利申请的分案申请。 专利
本专利技术涉及一种分离HCV-肽的方法，特别是分离具有结合 MHC/HLA分子的能力的HCVT细胞表位的方法。
技术介绍
免疫系统是相关细胞型和分子之间的一个复杂网络，为了保护多细胞 生物抵抗传染性微生物它们已经进化。能够分为进化较早的先天(或自然) 免疫和适应性(或获得性)免疫。先天免疫系统识別是对病原体通常共有的 和基本的模式。对于数量有限的分子结构，种系编码的受体已经进化。相 反，适应性免疫系统的细胞-B和T淋巴细胞-能够识别多种抗原结构。这 些受体，根据表达它们的细胞型，被命名为B细胞受体(BCR，其可溶性 形式称为抗体)和T细胞受体(TCR，只是细胞表面结合形式)，通过体细 胞重组产生，显示克隆分布。因此，最初只有少量细胞具有某种特异性。 在抗原遇到这些细胞后，开始分裂(克隆扩增)，产生能够对抗该抗原的效 应群体。在抗原清除后，特异识别这种抗原的特化细胞亚群仍然具有免疫 记忆。总之，适应性免疫系统是緩慢的(与先天免疫相比)，然而是特异的， 在重复暴露于一种指定病原体/抗原后增强。T细胞在适应性免疫中具有中心作用。它们的受体(TCR)识别细胞表 面上的"主要组织相容性复合物"(MHC或HLA):肽复合物。这些肽被称为 T细胞表位，代表抗原的降解产物。T细胞有两个主要类别:CD8阳性细 胞毒性T细胞(CTL)限于MHC I类。CD4阳性辅助T细胞(HTL)限于 MHCII类。HTL是适应性免疫的多种特征所必需的所谓"专业抗原呈 递细胞"(APC)的激活，免疫球蛋白(Ig)类别转换，生发中心反应和Ig亲 和力成熟，CTL的激活，免疫记忆，免疫应答的调节等。MHC分子收集细胞内的肽，在细胞表面将它们呈递给T细胞的TCR。 MHC有两个主要类别被CD8阳性CTL识别的I类，和被CD4 阳性HTL识别的II类。MHC I类分子由膜锚定的45 kDa的a链和非共价连接的12 kDa的 P2-微球蛋白(b2m)组成。通过X射线结晶法解析三维结构(Stern和Wiley 1994)显示a链有一个裂口，它在两端封闭，适应8-11个氨基酸长度的肽。 I类分子普遍表达，它们呈递的肽来源于胞质蛋白质。它们被蛋白酶体降 解，产生的肽被主动转运到内质网(ER)内。在几种侣伴蛋白的辅助下，在 此形成MHC:肽复合物，转运到细胞表面(Heemels 1995)。因此，MHC I 类在其表面上反映细胞的蛋白质组，使得T细胞能够识别细胞内病原体 或恶性细胞。MHC II类分子由分别为35 kDa和30 kDa的两种膜锚定蛋白质(a链 和P链)组成。它们一起构成了一个裂口，在两端开口，能够适应可变长度 的肽，通常12-25个氨基酸。尽管有这些不同，但是I类和II类分子具有 惊人的结构相似性(Stern和Wiley 1994)。II类分子只在专业APC上表达， 包括树突细胞(DC)、 B细胞和巨噬细胞/单核细胞。这些细胞专门以内体 途径摄取并加工抗原。在生物合成后，II类分子立即被所谓的恒定链(Ii) 复合，阻止ER内肽的结合。当含有II类:Ii复合物的小泡(vesicles)与含 有外源抗原的降解产物的内体融合时，Ii被降解，直到MHC结合的裂口 只被所谓的CLIP肽复合。后者在侣伴蛋白如HLA-DM的帮助下，与抗 原肽互换(Villadangos 2000)。最后，MHC:肽复合物再次在APC表面呈 递，它们以多种方式与HTL相互作用。MHC系统是多基因和极其多态性的，是高度复杂的。人类的I类a 链有三个基因座，被称为HLA-A、 -B和-C。同样，有三个II类a链基因 座(DRA、 DQA、 DPA)。至于II类P链基因座，情况更加复杂，因为有4 个不同的DRp链(DRBl、 2、 3、 5)加DQB和DPB。除了单态的DRot链 DRA之外，每个基因座存在于群体中的多个不同的等位基因中(几十个到 几百个)(Klein 1986)。不同的等位基因具有大大不同的肽结合特异性。例 如，等位基因净皮命名为 HLA-A*0201或HLA-DRB1*0401或 HLA-DPA*0101/DPB*0401。T细胞表位已经用多种方法鉴定(Van den Eynde 1997)。例如，T细 胞系和克隆已经用来在适当HLA分子转染的COS细胞中筛查cDNA表 达文库。此外，也利用生物化学方法。后者包括从靶细胞表面上的MHC 分子中洗脱天然配体，通过几个层析步骤分离这些肽，利用表位重建测定 分析它们与淋巴细胞的反应性，通过质谱法测序(W61fel等人1994， Cox 等人1994)。最近，高度灵敏的细胞因子检测试验如IFN-yELIspot的出现，允许 利用直接来自体内的淋巴细胞筛选重叠的合成肽(Maecker 2001， Kern 2000， Tobery 2001)。起初，Kern等人(1999和2000)使用重叠的9mer肽 库的阵列在体外对CD8+ T细胞表位作图。后来，Tobery等人，2001改进 了这一方法，证实含有多达64种20mer肽的库可以用来在小鼠中筛选 CD8+和CD4+ T细胞表位。这两种方法都是基于通过细胞内染色(Kern 等人2000)或ELIspot测定(Tobery等人，加01)测量INF-y的产生，监测抗 原特异性应答。利用15-mers的混合物，CD4+T细胞应答大约等于在使 用完整可溶性蛋白作为抗原时检测到的应答，而CD8+T细胞应答显著高 于利用可溶性蛋白刺激检测到的通常可以忽略的应答，这并不令人惊讶。 而且，对15氨基酸肽的混合物的CD8+ T细胞应答类似于利用选择代表 已知MHC I类最小表位的8-12氨基酸肽的混合物获得的应答。最可能的 是，在这些情况下，与细胞膜结合的肽酶负责将肽"修剪"成最佳长度 (Maecker等人，2001)。一个令人感兴趣的备选方法是用特异淋巴细胞筛查合成的组合肽文 库。例如，以定位扫描方式排列的200种混合物组成的十肽文库已经成功 用于鉴定刺激T细胞的克隆型群体的肽配体(Wilson等人，J. Immunol.， 1999， 163: 6424-6434)。许多T细胞表位已经用所谓的"反向免疫法"测定(Rammensee 1999)。 在这种情况下，产生可能的T细胞表位的蛋白质已知，对HLA结合基序 扫描其一级序列。 一般合成几十到几百个候选肽，乃至全套重叠肽，检测 它们与HLA分子的结合。通常选择最佳结合剂进一步表征它们与T细胞 的反应性。例如，借助HLA转基因小鼠，通过在体外或体内引发T细胞，能够实现该目的。丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒科(flaviviridiae)的一个成员，在世界范 围内慢性感染约1.7亿人。已经描述了至少6个HCV基因型和50个以上 的亚型。在美国、欧洲和曰本，基因型1、 2、 3最常见。HCV基因型的 地理分布随基因型不同变化很大，la主要分布于美国和西欧部分，而lb 在南欧和中欧占优势(Bellentani 2000)。HCV通过肠胃外或经皮肤(percutan)途径传播，在肝细胞中复制。本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离具有结合ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的能力的丙型肝炎病毒肽（ＨＰ），或含有该ＨＣＶ肽与该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的复合物的方法，该方法的特征在于下列步骤：　－提供一个ＨＣＶ肽库，该库含有可与该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子结合的ＨＣＶ肽和不与该ＭＨＣ／ＨＬＡ 分子结合的ＨＣＶ肽，　－使该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子接触该ＨＣＶ肽库，从而使具有结合该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的能力的ＨＣＶ肽与该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子结合，形成含有该ＨＣＶ肽和该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的复合物，　－检测该复合物，任选地使其与不结合 该ＭＨＣ／ＨＬＡ分子的ＨＣＶ肽分离，和　－任选地从该复合物中分离并表征该ＨＣＶ肽。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：M比施勒，A哈贝尔，C克雷德，F麦特内尔，O奥塔瓦，O维特维斯卡，W扎内尔，S津克，H克拉普斯，
申请(专利权)人：英特塞尔股份公司，
类型：发明
国别省市：AT[奥地利]