一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺，属于微生物发酵技术领域。本发明专利技术首先将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转化毕赤酵母GS115，为进一步提高表达量再将Hac1基因SEQ ID NO.3导入3拷贝胶原蛋白基因的重组毕赤酵母，并通过PTVA筛选出了COL

【技术实现步骤摘要】
一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白
α
1链的毕赤酵母及其发酵工艺


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，尤其涉及一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺。

技术介绍

[0002]人源胶原蛋白由于具备抗原性弱，利于细胞黏附，可诱导细胞增殖、分化，可为细胞长入胶原沉积和新血管形成提供支架，其降解产物也可为创面修复提供必须的氨基酸等优势，因而成为制备创面敷料、化妆品、组织工程、医疗器械等应用领域的重要材料。人体皮肤内胶原蛋白为I型胶原和III型胶原。成人皮肤组织中I型胶原蛋白比例较高，胎儿皮肤组织中Ⅲ型胶原蛋白比例明显较成人高。婴幼儿皮肤受损恢复后无瘢痕，其中Ⅲ型胶原蛋白起了主要作用，因而提高Ⅲ型胶原蛋白比例有望增加皮肤弹性，减轻瘢痕增生，所以Ⅲ型胶原蛋白在化妆品中更有应用价值。
[0003]人源Ⅲ型胶原蛋白由三条相同的α1链缠绕组成。随着生物工程技术的不断进步，利用基因工程生产人源胶原蛋白的技术近几年逐渐成熟，其中又分为第二代利用大肠杆菌表达重组人胶原蛋白的技术和利用毕赤酵母表达重组人胶原蛋白的第三代技术。从重组表达产量来看，人源Ⅲ型胶原蛋白α1单链很适合毕赤酵母分泌表达，产量较高，但存在发酵过程中降解较严重的问题。
[0004]国内外研究机构及企业对人或动物胶原蛋白单链的重组表达或者人工改造的研究及生产已有较多报道(Yang S et al.2021.Fermentationprocess withPichiayeast expressingrecombinant protein.US专利号011136373B2)；Dai L.et al.2019.Yeast strains and methods for producing collagen.US专利号20190002893A1；van Heerde GV et al.2012.Method for recombinant microorganism expression and isolation ofcollagen
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like polypeptides.US专利号008188230B2；He J et al.2015.New strategy for expression ofrecombinant hydroxylated human collagenα1(III)chains inPichiapastoris GS115.BiotechnolAppl Biochem.62(3):293
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9.doi:10.1002/bab.1264)。芬兰奥卢大学胶原蛋白研究中心对胶原蛋白的分泌表达和胞内表达进行了比较研究；美国的DavidR.Olsen等的研究表明I型胶原的基因中不含两端前肽基因时，表达量分别为原胶原的18倍、缺乏N前肽基因的4.6倍和缺乏C前肽基因的3倍，这些研究报道为利用毕赤酵母生产重组胶原蛋白提供了技术基础。胶原蛋白单链的生产技术目前是以毕赤酵母表达体系为最佳。完全按照天然氨基酸序列的毕赤酵母表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1单链的研究，其产量在4.5g/L以上，但由于分子量在90KD以上，对毕赤酵母表达造成一定影响，且由于存在多个蛋白酶降解位点，因而发酵过程中需要解决蛋白降解问题，代表性研究机构为西北大学范代娣课题组、江苏悦智生物医药有限公司(中国专利201911093124.8)。为此，不少研究机构的重组胶原蛋白产品是改变了氨基酸组成的类人胶原蛋白或明胶类似物，蛋白降解程度减小了，但由于氨基酸序列的改变，其应用存在局限性，该类产品的代表性研究
机构为南京理工大学和江苏江山聚源生物技术有限公司(中国专利201110327865.5、201810049618.5)。另外，基因辅表达策略，比如导入Hac1、PDI等辅表达基因(Han M.et al.2021.Increased Expression of Recombinant Chitosanase by Co
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expression of Hac1p in the Yeast Pichia pastoris.Protein Pept Lett.28(12):1434
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1441.doi:10.2174/0929866528666211105111155；Bao C.et al.2020.Expression and function of an Hac1
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regulated multi
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copy xylanase gene in Saccharomyces cerevisiae.Sci Rep 10(1):11686.doi:10.1038/s41598
‑
020
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68570
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6.)在毕赤酵母表达重组蛋白中已有一些实例的应用，但在有关胶原蛋白的重组表达中，尚未见应用报道。
[0005]在毕赤酵母高密度发酵工艺的研究中，对于减少胶原蛋白的降解已有一些文献报道。和Invitrogen公司“Pichia Fermentation Process Guidelines”推荐的工艺类似，中国专利202111190388.2提到在诱导期间一次性添加酪蛋白氨基酸15g/L可竞争性地减少重组胶原蛋白的降解；中国专利201810049618.5中提到，在甲醇诱导84h后，向发酵罐中一次性添加0.2～0.5M L
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赖氨酸或L
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精氨酸能有效防止目的产物被蛋白酶降解，且该工艺较添加酪蛋白氨基酸成本低。但中国专利201810049618.5是针对非天然序列的重组胶原蛋白，对于诱导初期就有降解现象发生的基于天然序列的重组胶原蛋白并不适用。因此，添加酪蛋白氨基酸的工艺有效，但工艺仍需提升、成本上仍需要降低。
[0006]上述背景表明，基于天然序列的人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的重组表达在菌株构建及减少蛋白降解的发酵工艺上均迫切需要开发新的技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺，所述重组毕赤酵母能够高效分泌表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链，相配套的高密度发酵工艺可以使得胶原蛋白降解率控制在10％以下，可降低纯化成本，满足化妆品原料等产品的应用要求。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]本专利技术提供一种重组毕赤酵母菌种，所述重组毕赤酵母菌种是将SEQ ID NO.1所示基因COL
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C、SEQ ID NO.3所示基因Hac1分别导入宿主菌，并以PTVA技术筛选优化的拷贝数组合获得的。
[0010]本专利技术所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115(购自Invitrogen)。
[0011]进一步地，胶原蛋白基因COL
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C优选自人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4，来本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链是由权利要求1所述的核苷酸序列编码表达获得的。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的核苷酸序列。4.一种重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种的基因组中整合有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种基因组中整合有3个拷贝的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及3个拷贝的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。6.如权利要求5所述的重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种通过下述步骤获得：(1)合成如SEQ ID NO.1所示的编码重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的核苷酸序列；...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱永常，秦倩茹，来灿钢，魏春，
申请(专利权)人：杭州纽龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：