一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因、RNA干扰序列及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因，属于植物病虫防治领域，所述致死基因包括Tret1，所述Tret1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。可基于该致死基因Tret1设计RNA干扰序列，高效诱发同源mRNA特异性降解，沉默Tret1基因在桃蚜体内的表达，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。本发明专利技术还提供一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列及其制备方法。防治桃蚜的RNA干扰序列及其制备方法。防治桃蚜的RNA干扰序列及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因、RNA干扰序列及其制备方法


[0001]本专利技术属于植物病虫防治领域，特别涉及一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因、RNA干扰序列及其制备方法。

技术介绍

[0002]桃蚜Myzus persicae属半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，在世界各地广泛分布，是十字花科蔬菜、烟草、辣椒、马铃薯、茄子等数百种作物的主要害虫之一，还可传播多种病毒病，给农业生产造成很大损失。目前桃蚜及其传播的病毒病主要依靠大面积使用农药来防控，给农业生产带来了严重的安全性问题。因此，生产上迫切需要一种安全绿色的防控新技术或策略，能够弥补化学防治弊端。
[0003]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由内源或外源的双链RNA引发的mRNA高效特异性降解，导致特异性阻碍靶标基因表达的现象。根据RNA干扰原理，筛选桃蚜的致死基因，通过制备RNA干扰制剂，能够安全高效地对桃蚜起到防治作用，是当前发展趋势下解决化学防治问题的良好途径，被誉为新一代害虫防治新技术。该技术是针对桃蚜的特异性基因设计，不会改变桃蚜的基因组，仅对桃蚜具有杀灭效果，具有特异性强、安全性高、致死率高、环境友好等优点，可实现桃蚜的绿色精准防控，能够有效减少化学农药对生态环境的破坏。

技术实现思路

[0004]为了解决农药防控桃蚜带来的安全性问题，本专利技术提供了一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因，可基于该致死基因Tret1设计RNA干扰序列，高效诱发同源mRNA特异性降解，沉默Tret1基因在桃蚜体内的表达，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。
[0005]本专利技术还提供了一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列及其制备方法。
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术提供一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因，所述致死基因包括Tret1，所述Tret1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列，所述RNA干扰序列为根据致死基因Tret1合成的dsRNA，所述RNA干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列的制备方法，包括：
[0010]克隆桃蚜Tret1基因的全长cDNA；
[0011]在Tret1基因的全长cDNA序列中选取RNAi的靶标区域，设计所述RNAi的靶标区域的PCR扩增引物Tret1
‑
F/Tret1
‑
R；
[0012]提取桃蚜总RNA，反转录合成cDNA,用所述Tret1
‑
F/Tret1
‑
R对所述RNAi的靶标区域进行PCR扩增，获得目的基因片段，将所述目的基因片段克隆到质粒载体并转化至感受态细胞中，提取质粒；
[0013]在所述Tret1
‑
F/Tret1
‑
R的5
’
端加上T7 promoter序列，获得引物dsTret1
‑
F/dsTret1
‑
R，以提取的质粒为模板进PCR扩增，获得带T7序列的目的基因，后利用MEGAscript T7Transcription Kit合成双链RNA，得到用于防治桃蚜的RNA干扰序列。
[0014]进一步的，所述克隆桃蚜Tret1基因的全长cDNA，具体包括：
[0015]提取桃蚜总RNA，合成cDNA；
[0016]基于桃蚜转录组数据库获得的Tret1基因序列设计Tret1基因上下游引物Tret1
‑
F1/Tret1
‑
R1或Tret1
‑
F2/Tret1
‑
R2，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化产物获得桃蚜Tret1基因的全长cDNA；
[0017]其中，所述Tret1
‑
F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Tret1
‑
R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Tret1
‑
F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Tret1
‑
R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018]进一步的，所述以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化产物获得桃蚜Tret1基因的全长cDNA，具体包括：
[0019]以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：Premix Taq酶12.5μL、cDNA模板1μL，正反向引物各1μL、ddH2O 9.5μL，反应程序为：95℃30s；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；
[0020]将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，纯化回收目的片段，获得桃蚜Tret1基因的全长cDNA。
[0021]进一步的，所述Tret1
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述Tret1
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0022]进一步的，所述dsTret1
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述dsTret1
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0023]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种用于防治桃蚜的RNA干扰试剂，包括dsRNA与纳米载体，所述dsRNA为上述用于防治桃蚜的RNA干扰序列，所述dsRNA与所述纳米载体的质量比为1:1。
[0024]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因在桃蚜防治中的用途。
[0025]基于同一专利技术构思，本专利技术还提供一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列在桃蚜防治中的用途。
[0026]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0027]1.本专利技术一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因，所述致死基因为桃蚜Tret1基因，该基因编码海藻糖转运蛋白，可基于该致死基因Tret1设计RNA干扰序列，诱发同源mRNA特异性降解，沉默Tret1基因在桃蚜体内的表达，影响桃蚜体内海藻糖的跨细胞膜转运，从而阻断了有机体能量代所需的源料物质，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。
[0028]2.本专利技术一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列，该RNA干扰序列为根据致死基因
Tret1合成的dsRNA，能够高效诱发同源mRNA特异性降解，沉默Tret1基因在桃蚜体内的表达，最终导致桃蚜繁殖力降低及桃蚜死亡，具有特异性强、安全性高、致死率高、环境友好等优点，有效减少化学农药对生态环境的破坏。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于RNA干扰防治桃蚜的致死基因，其特征在于，所述致死基因包括Tret1，所述Tret1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列，其特征在于，所述RNA干扰序列为根据权利要求1所述的致死基因合成的dsRNA，所述RNA干扰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种如权利要求2所述的用于防治桃蚜的RNA干扰序列的制备方法，其特征在于，包括：克隆桃蚜Tret1基因的全长cDNA；在Tret1基因的全长cDNA序列中选取RNAi的靶标区域，设计所述RNAi的靶标区域的PCR扩增引物Tret1
‑
F/Tret1
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R；提取桃蚜总RNA，反转录合成cDNA,用所述Tret1
‑
F/Tret1
‑
R对所述RNAi的靶标区域进行PCR扩增，获得目的基因片段，将所述目的基因片段克隆到质粒载体并转化至感受态细胞中，提取质粒；在所述Tret1
‑
F/Tret1
‑
R的5
’
端加上T7 promoter序列，获得引物dsTret1
‑
F/dsTret1
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R，以提取的质粒为模板进PCR扩增，获得带T7序列的目的基因，后利用MEGAscript T7 Transcription Kit合成双链RNA，得到用于防治桃蚜的RNA干扰序列。4.根据权利要求3所述的一种用于防治桃蚜的RNA干扰序列的制备方法，其特征在于，所述克隆桃蚜Tret1基因的全长cDNA，具体包括：提取桃蚜总RNA，合成cDNA；基于桃蚜转录组数据库获得的Tret1基因序列设计Tret1基因上下游引物Tret1
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F1/Tret1
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R1或Tret1
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F2/Tret1
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R2，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化产物获得桃蚜T...

【专利技术属性】
技术研发人员：张长禹，杨昌利，孟建玉，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：