人源胶原蛋白的基因制造技术

本申请公开了一种人源胶原蛋白的基因

【技术实现步骤摘要】
人源胶原蛋白的基因、该胶原蛋白的生产方法和检测方法


[0001]本申请涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种人源胶原蛋白的基因
、
该胶原蛋白的生产方法和检测方法
。

技术介绍

[0002]人源胶原蛋白由于具备抗原性弱，利于细胞黏附，可诱导细胞增殖
、
分化，可为细胞长入胶原沉积和新血管形成提供支架，其降解产物也可为创面修复提供必须的氨基酸等优势，因而成为制备创面敷料
、
化妆品
、
组织工程
、
医疗器械等应用领域的重要材料
。
[0003]胶原分子形成了一种特殊的超螺旋结构，由三条无链内氢键形成而仅受链间氢键支撑的多肽链组成
。
这种螺旋性的结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这3个氨基酸残基通常为
Gly
‑
X
‑
Pro。Gly
对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链，可以使胶原蛋白紧密堆积
。
在更高级的结构层次上，胶原超螺旋会进一步缔合成为胶原原纤维
。
在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化
、
糖基化
、
相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控
。
原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部
。
没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性
。
因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构
。
这样的困难严重阻碍了人源胶原蛋白的研发和生产；
[0004]生产胶原蛋白的传统方法是利用酸
、
碱
、
酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物
。
这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能
。
随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物
、
植物和微生物表达体系中制备重组人胶原蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点
。
国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产
。

技术实现思路

[0005]本申请的内容部分用于以简要的形式介绍构思，这些构思将在后面的具体实施方式部分被详细描述
。
本申请的内容部分并不旨在标识要求保护的技术方案的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求的保护的技术方案的范围
。
[0006]为了解决以上
技术介绍
部分提到的技术问题，本申请的第一目的提供了一种人源胶原蛋白的基因，其特征在于，该基因序列具有序列表中
SEQID
：
NO.1
所示的核苷酸序列
。
[0007]本申请的第二目的提供了一种源胶原蛋白的生产方法，包括以下步骤：大肠杆菌基因工程菌的构建；大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；重组人源胶原蛋白的诱导和表达；重组人源胶原蛋白的纯化
。
[0008]进一步地，所述大肠杆菌基因工程菌的构建的方法包括：优化选择人的Ⅲ型胶原蛋白基因的
DNA
片段，并合成重组质粒；将重组基因转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌
。
[0009]进一步地，所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养的方法包括：在
LB
液体培养基中加
0.1
％
50
μ
g/mL
卡那
kana
抗生素，挑取单菌落，混匀置于
37℃220rpm
摇床中培养
12h
；在
LB
液体培养基中加入
0.1
％
50
μ
g/mL
卡那
kana
抗生素，再加入
1.0
％的过夜培养的菌液，置于
37℃、220rpm
摇床中培养，培养至进入对数生长期测定
OD600
值为
0.4
‑
0.6
后，加入诱导剂
IPTG
诱导，诱导条件为低温
16℃、220rpm
诱导
24h。
[0010]进一步地，所述重组人源胶原蛋白的纯化的方法包括：用
Tris
缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白
。
[0011]本申请的第三目的是提供一种人源胶原蛋白的检测方法，包括以下步骤：
[0012]对人源胶原蛋白的进行
MTT
实验，获取
MTT
实验结果；对人源胶原蛋白的进行细胞划痕实验，获取细胞划痕实验结果；对人源胶原蛋白的进行细胞粘附性测定和相对粘附性计算，获取计算结果
。
[0013]进一步地，对人源胶原蛋白的进行
MTT
实验，获取
MTT
实验结果的方法包括：
[0014]将
BALB/3T3
细胞于
37℃
，5％
CO2细胞培养箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞密度及状态
。
当细胞生长至培养瓶的
80
‑
90
％时进行细胞传代或细胞接种
。
使用完全培养基，将细胞以3×
103个
/
孔种于
96
孔板，每孔
100
μ
L
，设置四个复孔，于
37℃、5
％二氧化碳条件下培养
24
小时，然后换成维持培养液进行饥饿处理
24
小时；弃去维持培养液，分别加入
100
μ
L
维持培养基配制的重组胶原蛋白，终浓度为
0mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL。
于
37℃、5
％二氧化碳条件下培养
72
小时
。
空白对照组只加入维持培养基；每孔加入
MTT
溶液
10
μ
L
，于
37℃、5
％二氧化碳条件下培养4小时
。
小心吸弃孔中的上清，向每孔中加入
100
μ
LDMSO
，充分吹打混匀后放入酶标仪，在波长
570nm
处测定吸光值，获取
MTT
实验结果
。
[0015]进一步地，对人源胶原蛋白的进行细胞划痕本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种人源胶原蛋白的基因，其特征在于，该基因序列具有序列表中
SEQID
：
NO.1
所示的核苷酸序列
。2.
一种人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：大肠杆菌基因工程菌的构建；大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；重组人源胶原蛋白的诱导和表达；重组人源胶原蛋白的纯化
。3.
根据权利要求2所述的人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于：所述大肠杆菌基因工程菌的构建的方法包括：优化选择人的Ⅲ型胶原蛋白基因的
DNA
片段，并合成重组质粒；将重组基因转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌
。4.
根据权利要求3所述的人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于：所述大肠杆菌基因工程菌的发酵培养的方法包括：在
LB
液体培养基中加
0.1
％
50
μ
g/mL
卡那
kana
抗生素，挑取单菌落，混匀置于
37℃220rpm
摇床中培养
12h
；在
LB
液体培养基中加入
0.1
％
50
μ
g/mL
卡那
kana
抗生素，再加入
1.0
％的过夜培养的菌液，置于
37℃、220rpm
摇床中培养，培养至进入对数生长期测定
OD600
值为
0.4
‑
0.6
后，加入诱导剂
IPTG
诱导，诱导条件为低温
16℃、220rpm
诱导
24h。5.
根据权利要求4所述的人源胶原蛋白的生产方法，其特征在于：所述重组人源胶原蛋白的纯化的方法包括：用
Tris
缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；利用镍离子亲和柱从上清液中纯化得到重组人源胶原蛋白
。6.
一种人源胶原蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：对人源胶原蛋白的进行
MTT
实验，获取
MTT
实验结果；对人源胶原蛋白的进行细胞划痕实验，获取细胞划痕实验结果；对人源胶原蛋白的进行细胞粘附性测定和相对粘附性计算，获取计算结果
。7.
根据权利要求6所述的人源胶原蛋白的检测方法，其特征在于：对人源胶原蛋白的进行
MTT
实验，获取
MTT
实验结果的方法包括：将
BALB/3T3
细胞于
37℃
，5％
CO2细胞培养箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞密度及状态
。
当细胞生长至培养瓶的
80
‑
90
％时进行细胞传代或细胞接种
。
使用完全培养基，将细胞以3×
103个
/
孔种于
96
孔板，每孔
100
μ
L
，设置四个复孔，于
37℃、5
％二氧化碳条件下培养
24
小时，然后换成维持培养液进行饥饿处理
24
小时；弃去维持培养液，分别加入
100
μ
L
维持培养基配制的重组胶原蛋白，终浓度为
0mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL。
于
37℃、5
％二氧化碳条件下培养
72
小时
。
空白对照组只加入维持培养基；每孔加入
MTT
溶液
10
μ
L
，于
37℃、5
％二氧化碳条件下培养4小时
。
小心吸弃孔中的上清，向每孔中加入
100
μ
LDMSO
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高振飞，钱永常，张科，来灿钢，
申请(专利权)人：杭州纽龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：