Hakai制造技术

本发明专利技术公开了涉及

【技术实现步骤摘要】
Hakai基因在RP疾病模型构建中的应用及构建方法


[0001]本专利技术涉及医学工程
，具体而言，涉及
Hakai
基因在
RP
疾病模型构建中的应用及构建方法
。

技术介绍

[0002]目前，视网膜色素变性
(Retinitispigmentosa
，
RP)
是一种导致视力丧失的进行性
、
遗传性致盲眼底病，通常为视网膜光感受器异常所致，临床要表现为慢性进行性视野缺失，夜盲，色素性视网膜病变和视网膜电图异常，最终可导致失明
。
目前比较缺乏研究
RP
的疾病模型
。
[0003]鉴于此，特提出本专利技术
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供
Hakai
基因在
RP
疾病模型构建中的应用及构建方法
。
本专利技术发现敲除动物体中的
Hakai
基因可导致动物体表现出
RP
疾病相关特征，该动物体可以作为
RP
疾病模型，本专利技术为
RP
疾病的研究以及为筛选治疗该疾病的药物提供了一种新的
RP
疾病模型，丰富了
RP
疾病研究的模型
。
[0005]本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术提供了一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其包括如下任意一种的方法：（1）敲除非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的
Hakai
基因；（2）通过基因沉默技术使得非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的
Hakai
基因的表达量下降
。
[0006]HAKAI
最初被鉴定为
E
‑
钙粘蛋白复合物的环指型
E3
泛素连接酶，
E
‑
钙粘素复合物是粘附分子连接的主要成分
。HAKAI
与
E
‑
钙粘蛋白的细胞质结构域结合，并介导其泛素化
、
内吞作用和溶酶体降解
。E
‑
钙粘蛋白的缺失导致上皮细胞
‑
细胞粘附的破坏，这是上皮转化的关键事件，并促进侵袭和转移
。E
‑
钙粘蛋白的细胞质结构域通过
β
‑
连环蛋白和
α
‑
连环蛋白等蛋白与细胞骨架相连，这些蛋白参与调节细胞增殖
、
分化和存活的信号通路
。
在几种酪氨酸激酶（如
EGF
或
HGF
受体）激活后，
E
‑
钙粘蛋白复合物在酪氨酸残基处被磷酸化
。E
‑
钙粘蛋白的磷酸化促进其被
HAKAI
识别，随后
E
‑
钙粘蛋白水解和从细胞
‑
细胞接触中清除
。HAKAI
在降低上皮细胞中的细胞
‑
细胞接触方面发挥着至关重要的作用，这对肿瘤的发生发展是至关重要的
。
[0007]在过去的几十年里，
HAKAI
主要在上皮
‑
间质转化和癌症进展的背景下进行研究
。
然而，越来越多的数据发现
HAKAI
也是脊椎动物和植物中
m6A
生物发生机制的一个组成部分
。HAKAI
被鉴定为哺乳动物细胞中最强的
WTAP
相互作用因子之一，也是包括
WTAP、VIRMA
和
ZC3H1339
在内的进化保守蛋白复合体的一部分
。
此外，拟南芥中的
HAKAI
突变体表现出轻微的发育缺陷，同时
m6A
水平降低
。
最近，在果蝇
S2R+
细胞的
Spenito
（
Nito
）相互作用组中鉴定
出
HAKAI
是最富集的蛋白质之一，这表明
HAKAI
在
m6A
通路中的进化保守作用
。
[0008]HAKAI
在心
、
脑
、
肝
、
视网膜等多个组织都有表达，目前针对
HAKAI
蛋白功能在小鼠体内的研究报道并不多，且尚无
HAKAI
在视网膜组织中的研究
。
因此，深入研究
HAKAI
在小鼠视网膜中的具体作用机制，对
RP
疾病的治疗及病因探讨潜力巨大
。
[0009]本专利技术的专利技术人首次发现，在目标动物的视网膜视杆细胞中敲除
Hakai
基因或沉默
Hakai
基因，可以使得目标动物表现出
RP
疾病相关特征
。
因此，视网膜视杆细胞中的
Hakai
基因被敲除或沉默的动物可以作为
RP
疾病模型，用于
RP
疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程
、
机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型
。
[0010]在本专利技术应用较佳的实施方式中，敲除
Hakai
基因是指敲除
Hakai
基因的外显子序列或全长序列
。
敲除
Hakai
基因可以是敲除
Hakai
基因全长序列，也可以是敲除
Hakai
基因部分序列例如部分外显子序列，无论敲除那种类型（部分或全长）的序列，只要是能够在视杆细胞中实现
Hakai
基因的敲除或沉默
Hakai
基因的表达，使动物表现出
RP
疾病相应特征即属于本专利技术的保护范围
。
[0011]小鼠
Hakai
基因（
Casitas B
‑
lineage lymphoma
‑
like 1
，
MGI: 2144842
）位于小鼠
12
号染色体
31,534,828
‑
31,549,615bp
，全长
14.787kb
，其
cDNA
全长
4007bp
，包含6个外显子
。
[0012]在本专利技术应用较佳的实施方式中，敲除
Hakai
基因是指敲除
Hakai
基因的第1号到第6号外显子中的至少一个外显子序列；本领域的技术人员可以根据需要选择敲除
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括如下任意一种的方法：（1）敲除非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的
Hakai
基因；（2）通过基因沉默技术使得非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的
Hakai
基因的表达量下降
。2.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，敲除
Hakai
基因是指敲除
Hakai
基因的外显子序列或全长序列
。3.
根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，敲除
Hakai
基因是指敲除
Hakai
基因的第1号到第6号外显子中的至少一个外显子序列
。4.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述敲除采用的是选自
CRISPR/Cas9
技术
、CRISPR/Cas12a
技术
、CRISPR/Cas13a
技术
、
人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术
、
转录激活因子样效应物核酸酶技术和
Cre
‑
loxp
基因敲除技术中的至少一种
。5.
根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将含非人目标动物
Hakai
基因的
gRNA
载体或向导
RNA
复合物
、Cas9 mRNA
或
Cas9 蛋白
、Hakai
基因的同源模板序列
、
通过转化或化学转染至非人目标动物的受精卵中，取胚胎细胞移植到假孕非人目标动物的子宫中，获得
Hakai
基因条件性敲除的首建动物；将首建动物进行交配，筛选
Hakai
基因条件性敲除纯合子动物；再将
Hakai
基因条件性敲除纯合子动物与带有
Cre
基因的动物交配获得
Hakai
基因敲除的动物；所述
gRNA
载体或向导
RNA
复合物包括用于靶向
Hakai
基因的
gRNA
；所述
Hakai
基因的同源模板序列包括
Hakai
基因，且在
Hakai
基因的两端设置有
loxp
位点；所述
Cas9 蛋白为
Cas9 蛋白或经修饰的
Cas9 蛋白
。6.
根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱献军，孙宽祥，杨业明，陈君尧，杨牧，蔡金锐，
申请(专利权)人：四川省医学科学院，
类型：发明
国别省市：