一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，属于生物医药技术领域。所述制备方法包括以下步骤：首先采用氧化剂对辣根过氧化物酶进行氧化，然后加入生物素酰肼与氧化后的辣根过氧化物酶进行偶联反应，得到所述生物素化辣根过氧化物酶。本发明专利技术采用生物素小分子与辣根过氧化物酶形成缀合物，辣根过氧化物酶反应完全，使得纯化方法简单；辣根过氧化物酶生物素化过程不影响辣根过氧化物酶酶活性，小分子物质偶联蛋白后，对蛋白活性几乎不影响，产物活性保留率较高；生物素化的产物与链霉亲和素的定向结合能力强，能有效检测带有链霉亲和素的抗原及抗体；并且小分子物质几乎不存在非特异性结合，能有效降低检测底色，降低错检率。错检率。错检率。

【技术实现步骤摘要】
一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法。

技术介绍

[0002]辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)，分布于植物界，辣根中含量较高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，分子量40kDa左右，糖含量18％。由于辣根过氧化物酶与特定的底物反应，能产生有颜色或发光的产物，使得其在分子生物学和蛋白质研究中主要应用于免疫测定和其他基于探针的测定技术(例如ELISA、Western印迹、EMSA和Southern印迹)。
[0003]目前市面上传统的辣根过氧化物酶标记物多与抗体进行偶联。此偶联方式多利用抗体或酶上的氨基或巯基进行定向偶联。由于抗体分子大小不同，以及不同抗体上游离氨基巯基数量的限制，一个抗体上往往只能连接1
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2个HRP分子，一定程度上会影响到检测的灵敏性。此外，利用抗体偶联后进行后续检测，抗体的非特异性吸附会使得检测底色偏高，影响检测质量。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术中的上述问题，本专利技术提供了一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，针对传统偶联方法的不足，提出一种新的辣根过氧化物酶标记物及其制备方法，从而达到简化纯化流程，增加检测灵敏性，降低检测底色的目的。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：首先采用氧化剂对辣根过氧化物酶进行氧化，将辣根过氧化物酶糖基化上的羟基氧化成醛基，然后加入生物素酰肼与氧化后的辣根过氧化物酶进行偶联反应，得到所述生物素化辣根过氧化物酶。
[0007]进一步地，所述氧化剂为高碘酸钠，优选为高碘酸钠；所述辣根过氧化物酶与所述氧化剂的摩尔比为1∶(2～500)，优选为优选1∶(50～200)，更优选1∶(50～100)。
[0008]进一步地，所述氧化在避光环境中进行，温度为2～25℃，时间为1～6h，优选为2～5h，更优选为3～4h。
[0009]之所以在避光环境中进行氧化，是由于氧化剂高碘酸钠遇光容易分解。
[0010]进一步地，所述辣根过氧化物酶与所述生物素酰肼的摩尔比为1∶(10～500)，优选为1∶(100～400)，更优选为1∶(200～300)。
[0011]进一步地，所述偶联反应的温度为10～25℃，时间为2～24h，优选为2～10小时，更优选为2～4小时。
[0012]进一步地，所述氧化在缓冲液体系中进行；所述缓冲液体系为5～100mmol/L醋酸
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醋酸钠缓冲液，优选为10～50mmol/L醋酸
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醋酸钠缓冲液，更优选为10～20mmol/L醋酸
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醋
酸钠缓冲液。
[0013]进一步地，所述氧化和所述偶联反应后均还包括纯化的操作，其中氧化后进行纯化是为了除去多余的氧化剂，偶联反应后进行纯化是为了除去多余的生物素酰肼，以得到纯化的生物素化辣根过氧化物酶。
[0014]进一步地，所述纯化方法为透析或超滤，优选为透析；所述纯化在2～8℃下进行。
[0015]更进一步地，所述透析采用的透析袋截留分子量为3～30KDa，优选为10～20KDa；透析液体积为反应液体积的50～500倍，优选为100～400倍，更优选为200～300倍；透析时间为6～24h，优选为10～24h，更优选为18～24h。
[0016]本专利技术还提供了一种根据上述所述的制备方法制备得到的生物素化辣根过氧化物酶。
[0017]本专利技术同时提供了上述所述的生物素化辣根过氧化物酶在检测带有链霉亲和素的抗原及抗体中的应用。
[0018]本专利技术所涉及的辣根过氧化物酶主要来源于辣根植物，是一种分子量约为40kDa的糖蛋白，含糖量约为18％。本专利技术的原理是利用高碘酸钠将蛋白糖基化的羟基氧化成醛基，然后利用生物素酰肼的酰肼基团与醛基形成永久性的席夫碱(Schiff base)。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]本专利技术采用生物素小分子与辣根过氧化物酶形成缀合物，辣根过氧化物酶反应完全，使得纯化方法简单易行；辣根过氧化物酶生物素化过程不影响辣根过氧化物酶酶活性，小分子物质偶联蛋白后，对蛋白活性几乎不影响，故产物活性保留率较高；生物素化的产物与链霉亲和素的定向结合能力强，能有效检测带有链霉亲和素的抗原及抗体；并且小分子物质几乎不存在非特异性结合，能有效降低检测底色，降低错检率。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为实施例1制备得到的生物素化HRP使用ST3纯化柱纯化电泳图；
[0023]图2为实施例2制备得到的生物素化HRP应用于狭缝印迹实验显色中所得结果图。
具体实施方式
[0024]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。
[0025]另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0026]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规
技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0027]在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本专利技术说明书和实施例仅是示例性的。
[0028]关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0029]以下实施例中，所采用的辣根过氧化物酶购自阿拉丁试剂平台，分子量约44KDa，含糖量为约18％；所采用的生物素酰肼购自阿拉丁试剂平台。以下不再重复描述。
[0030]实施例1
[0031]生物素化辣根过氧化物酶的制备，步骤如下：
[0032](1)取2mg(0.045本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物素化辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先采用氧化剂对辣根过氧化物酶进行氧化，然后加入生物素酰肼与氧化后的辣根过氧化物酶进行偶联反应，得到所述生物素化辣根过氧化物酶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为高碘酸钠，所述辣根过氧化物酶与所述氧化剂的摩尔比为1∶(2～500)。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化在避光环境中进行，温度为2～25℃，时间为1～6h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶与所述生物素酰肼的摩尔比为1∶(10～500)。5.根据权利要求1所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱永常，钟达，来灿钢，林定，
申请(专利权)人：杭州纽龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：