一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物医药的技术领域，公开了一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法及其应用，所述制备方法包括如下步骤：（1）将生物素

【技术实现步骤摘要】
一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药的
，尤其是涉及一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和甲醇等有机溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC主要用于荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光。由于人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色，因而采用FITC所发出的绿色荧光进行医学诊断能够提高准确性，应用十分广泛。
[0003]目前大部分FITC的偶联都选择抗体偶联，利用FITC的硫氰根与抗体的氨基进行定向偶联。由于抗体分子大小不同，以及不同抗体上游离氨基数量的限制，一个抗体上往往只能连接1
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2个FITC分子，一定程度上会影响到检测的灵敏性。此外，抗体的非特异性吸附可能会导致错检，假阳的发生，都会影响检测结果的准确性。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供了一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法及其应用，利用FITC的异硫氰酸基团与生物素胺的氨基进行定向偶联，得到的生物素化异硫氰酸荧光素能够在抗体偶联进行荧光检测时，有效提高检测灵敏度和准确性。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：第一方面，本专利技术提供了一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法，包括如下步骤：（1）将生物素
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PEG
n
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胺与异硫氰酸荧光素分别溶解后混合，再加入有机碱溶液，避光反应，得到反应混合液；其中n为PEG的聚合度，取值范围为1~50；（2）将反应混合液采用硅胶层析柱纯化，再进行后处理，得到生物素化异硫氰酸荧光素。
[0006]本专利技术是利用FITC的异硫氰酸基团与生物素胺的氨基进行定向偶联，形成稳定的共价键。然后利用产物及原料的极性差异，在硅胶柱上实现分离纯化，得到生物素化异硫氰酸荧光素。
[0007]现有技术中，常利用FITC的异硫氰酸基团与链霉亲和素偶联，链霉亲和素再与生物素结合。相比于该方法，本专利技术的有利效果在于：首先，生物素相对于链霉亲和素为小分子，FITC和生物素的小分子间的偶联相比大分子偶联效率更高；其次，1个链霉亲和素分子能够结合4个生物素分子，将FITC与生物素偶联才会有放大荧光强度和检测信号的效果，进而有效提高检测灵敏度。
[0008]另外，将FITC的异硫氰酸基团与链霉亲和素偶联，链霉亲和素为大分子，在荧光显色的时候不容易将荧光分子完全暴露出来，会影响检测的准确性。而本专利技术利用FITC与生物素偶联，虽然生物素
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PEG
n
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胺仅能够偶联单个荧光分子，但是其特异性结合的效率更高，在生物素分子和链霉亲和素分子结合时，能够利用链霉亲和素分子的大分子结构以及PEG长链有效地暴露出荧光分子，提高荧光显色的灵敏度。生物素
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PEG
n
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胺中n的取值范围为1~50，优选为1~20，进一步优选为1~5。但是，n越大，生物素
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PEGn
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胺的分子量越大，PEG的聚合度不宜过大，长链形成的空间位阻会影响相邻生物素与链霉亲和素分子的结合、以及链霉亲和素分子与抗体的偶联。
[0009]作为优选，步骤（1）中，所述异硫氰酸荧光素和生物素
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PEG
n
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胺的摩尔比为1：1~50，优选为1：1~20，进一步优选为1：1~10。
[0010]作为优选，步骤（1）中，所述避光反应的时间为2~24h，优选为6~20h，进一步优选为10~20h。
[0011]作为优选，步骤（1）中，所述异硫氰酸荧光素为异硫氰酸荧光素的Ⅰ型异构体和/或Ⅱ型异构体。
[0012]异硫氰酸荧光素有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。5
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FITC为Ⅰ型异构体，6
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FITC为Ⅱ型异构体，5
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FITC的异硫氰酸基团连接在苯环的C4位置，而6
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FITC的异硫氰酸基团连接在苯环的C5位置。
[0013]作为优选，步骤（1）中，所述溶解的溶剂为二氯甲烷或甲醇；所述有机碱为二异丙醇胺或三乙胺。
[0014]作为优选，步骤（2）中，所述硅胶层析柱中的硅胶大小为20~400目，优选为100~300目，进一步优选为200~300目；硅胶层析所用洗脱液为石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯中的一种或几种混合。
[0015]硅胶目数越大，颗粒粒径越小，分离效果就越好，同时，目数越大，流速越慢，纯化时间越长。
[0016]作为优选，步骤（2）中，所述后处理为：将纯化后产物减压蒸馏去除溶剂，再进行复溶，复溶后的产物烘干，得到固体粉末。
[0017]作为优选，所述复溶的溶剂为二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯中的一种或几种混合；所述烘干的温度为50~100℃，时间为5~24h。
[0018]第二方面，本专利技术还提供了上述制备方法制得的生物素化异硫氰酸荧光素在免疫荧光检测中的应用，包括如下步骤：将生物素化异硫氰酸荧光素和链霉亲和素结合，用于免疫荧光检测。
[0019]由于1个链霉亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，进而可以连接更多的FITC分子，能有效放大检测的荧光强度信号，再与抗体偶联用于免疫荧光检测时，能够有效提高检测的灵敏度以及检测结果的准确性。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）利用FITC的异硫氰酸基团与生物素胺的氨基进行定向偶联，形成稳定的共价键，小分子间特异性结合的效率更高，并且能够有效地暴露出荧光分子，提高荧光显色的灵敏度；（2）通过生物素化异硫氰酸荧光素与链霉亲和素分子结合，进而可以连接更多的
FITC分子，能有效放大检测的荧光强度信号，有效提高检测的灵敏度。
附图说明
[0021]图1为本专利技术中反应产物及纯化产物TLC分析（1为5
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FITC，2为反应混合液，3为洗脱杂质，4为洗脱产物，5为硅胶柱残留样品）；图2为本专利技术中实施例6的链霉亲和素条带的荧光显色图；图3为本专利技术中实施例7的链霉亲和素条带的荧光显色图。
具体实施方式
[0022]以下用具体实施例来说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不限于此：实施例1生物素化异硫氰酸荧光素的制备：（1）取10mg异硫氰酸荧光素（5
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FITC）溶于0.2ml甲醇中，另取10.75mg生物
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PEG3‑
胺溶于1.8ml二氯甲烷中，将两者混合后，往混合溶液中加入0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将生物素
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PEG
n
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胺与异硫氰酸荧光素分别溶解后混合，再加入有机碱溶液，避光反应，得到反应混合液；其中n为PEG的聚合度，取值范围为1~50；（2）将反应混合液采用硅胶层析柱纯化，再进行后处理，得到生物素化异硫氰酸荧光素。2.如权利要求1所述生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述异硫氰酸荧光素和生物素
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PEG
n
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胺的摩尔比为1：1~50。3.如权利要求1或2所述生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述避光反应的时间为2~24h。4.如权利要求1或2所述生物素化异硫氰酸荧光素的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述异硫氰酸荧光素为异硫氰酸荧光素的Ⅰ型异构体和/或Ⅱ型异构体。5.如权利要求1或2所述生物素化异硫氰酸荧光素...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱永常，钟达，来灿钢，林定，
申请(专利权)人：杭州纽龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：