一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，包括采用生物素琥珀酰亚胺与碱性磷酸酶在碱性条件下进行偶联反应；将偶联反应后的混合物进行纯化，以得到生物素化碱性磷酸酶。本发明专利技术采用生物素琥珀酰亚胺与氨基偶联，只需进行一步反应，极大的简化了修饰工艺，且修饰产物与采用糖基化修饰，活性相当。所用原料对比，糖基化修饰所用的原料生物素酰肼的价格大约是氨基修饰所用原料生物素琥珀酰亚胺的6

【技术实现步骤摘要】
一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法。

技术介绍

[0002]碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AP)是一种膜结合糖蛋白，分子量约140KDa。在pH值呈碱性的环境下可催化磷酸单酯水解，AP是免疫诊断试剂中最常见的标记酶之一。与辣根过氧化物酶(HRP)相比，碱性磷酸酶具有稳定性和高敏感性的优势。AP在生物学尤其是分子生物学和免疫学领域有着广泛的应用，然而，AP的标记是昂贵和费力的。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
[0004]本专利技术为实现上述专利技术目的采用如下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，包括：
[0006]采用生物素琥珀酰亚胺与碱性磷酸酶在碱性条件下进行偶联反应；
[0007]将偶联反应后的混合物进行纯化，以得到生物素化碱性磷酸酶。
[0008]进一步地，所述碱性磷酸酶与生物素琥珀酰亚胺的投料摩尔比为1：(5～100)。
[0009]进一步地，所述碱性磷酸酶与生物素琥珀酰亚胺的偶联反应pH为7.5～9.0。
[0010]进一步地，所述碱性磷酸酶与生物素琥珀酰亚胺的偶联反应温度为2～25℃。
[0011]进一步地，所述碱性磷酸酶与生物素琥珀酰亚胺的偶联反应时间为1～24h。
[0012]进一步地，所述纯化的方法为透析或超滤。
[0013]进一步地，所述纯化的温度为2～8℃。
[0014]进一步地，所述透析采用的透析袋截留分子量为3～30KDa。
[0015]进一步地，所述透析采用的透析液体积为反应液体积的50～500倍。
[0016]进一步地，所述透析的时间为6～24h。
[0017]本专利技术的有益效果如下：
[0018]采用生物素琥珀酰亚胺与氨基偶联，只需进行一步反应，极大的简化了修饰工艺，且修饰产物与采用糖基化修饰，活性相当。所用原料对比，糖基化修饰所用的原料生物素酰肼的价格大约是氨基修饰所用原料生物素琥珀酰亚胺的6
‑
10倍。本专利技术不仅极大的简化了工艺，而且也极大的降低了原料成本。
附图说明
[0019]图1为根据本专利技术实施例提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法的流程框图；
[0020]图2为根据本专利技术实施例提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法中生物素化AP产品ST3纯化样品电泳图；
[0021]图3为根据本专利技术实施例提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法中生物素化AP 1:30000稀释后孵育图。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。
[0023]实施例1
[0024]本专利技术提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，步骤如下：
[0025](1)取2mg(约0.014微摩尔)碱性磷酸酶，体系10mM PB,pH7.5，体积1ml。
[0026](2)往碱性磷酸酶溶液中加入约0.07微摩尔生物素琥珀酰亚胺进行混合反应，反应温度25℃，反应时间1h。
[0027](3)反应完成后样品倒入3KDa透析袋透析，透析温度2℃，透析液为0.01mol/L PBS，pH7.40，体积200ml，透析时间16小时。即得到生物素化碱性磷酸酶。
[0028]实施例2
[0029]本专利技术提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，步骤如下：
[0030](1)取2mg(约0.014微摩尔)碱性磷酸酶，体系10mM PB,pH8.5，体积1ml。
[0031](2)往碱性磷酸酶溶液中加入约0.28微摩尔生物素琥珀酰亚胺进行混合反应，反应温度2℃，反应时间24h。
[0032](3)反应完成后样品倒入3KDa透析袋透析，透析温度4℃，透析液为0.01mol/L PBS，pH7.40，体积300ml，透析时间16小时。即得到生物素化碱性磷酸酶。
[0033]实施例3
[0034]本专利技术提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，步骤如下：
[0035](1)取2mg(约0.014微摩尔)碱性磷酸酶，体系10mM PB，pH8.0，体积1ml。
[0036](2)往碱性磷酸酶溶液中加入约7微摩尔生物素琥珀酰亚胺进行混合反应，反应温度8℃，反应时间3h。
[0037](3)反应完成后样品倒入7KDa透析袋透析，透析温度8℃，透析液为0.01mol/L PBS，pH7.40，体积500ml，透析时间6小时。即得到生物素化碱性磷酸酶。
[0038]实施例4
[0039]本专利技术提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，步骤如下：
[0040](1)取2mg(约0.014微摩尔)碱性磷酸酶，体系10mM PB,pH8.5，体积1ml。
[0041](2)往碱性磷酸酶溶液中加入约4.2微摩尔生物素琥珀酰亚胺进行混合反应，反应温度16℃，反应时间16h。
[0042](3)反应完成后样品倒入7KDa透析袋透析，透析温度4℃，透析液为0.01mol/L PBS，pH7.40，体积100ml，透析时间24小时。即得到生物素化碱性磷酸酶。
[0043]实施例5
[0044]本专利技术提供的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，步骤如下：
[0045](1)取2mg(约0.014微摩尔)碱性磷酸酶，体系10mM PB,pH7.5，体积1ml。
[0046](2)往碱性磷酸酶溶液中加入约0.7微摩尔生物素琥珀酰亚胺进行混合反应，反应温度20℃，反应时间5h。
[0047](3)反应完成后样品倒入30KDa透析袋透析，透析温度4℃，透析液为0.01mol/L PBS，pH7.40，体积50ml，透析时间16小时。即得到生物素化碱性磷酸酶。
[0048]效果验证
[0049]1.生物素化AP进行ST3填料纯化，ST3填料能特异性结合生物素，并部分可以被D
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生物素竞争性洗脱。并将纯化收集样品进行SDS
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PAGE检测，具体步骤如下：
[0050](1)取ST3填料1mL，装入纯化柱中，纯水冲洗3mL，0.01mol/L PBS，pH7.40冲洗纯化柱3mL，待上样。
[0051](2)取实施例1制备得到的生物素化AP 1mL，上样至处理完的ST3纯化柱，收集流穿样品1mL，用0.01mol/L PBS，pH7.40平衡纯化柱3mL，收集平衡样品3mL。
[0052](3)用50mmol/L D
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生物素水溶液、pH8.00洗脱纯化柱3mL，收集洗脱样品3mL。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，包括：采用生物素琥珀酰亚胺与碱性磷酸酶在碱性条件下进行偶联反应；将偶联反应后的混合物进行纯化，以得到生物素化碱性磷酸酶。2.根据权利要求1所述的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶与生物素琥珀酰亚胺的投料摩尔比为1：(5～100)。3.根据权利要求1所述的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶与生物素琥珀酰亚胺的偶联反应pH为7.5～9.0。4.根据权利要求1所述的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶与生物素琥珀酰亚胺的偶联反应温度为2～25℃。5.根据权利要求1所述的一种生物素化碱性磷酸酶的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟达，钱永常，来灿钢，山依莎，
申请(专利权)人：杭州纽龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：