一种rh-TM-bFGF基因、重组质粒、蛋白、制备方法和应用技术

本申请公开了一种rh

【技术实现步骤摘要】
一种rh
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TM
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bFGF基因、重组质粒、蛋白、制备方法和应用


[0001]本申请涉及生物基因工程领域，具体而言，涉及一种rh
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TM
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bFGF基因、重组质粒、蛋白、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]人碱性成纤维细胞生长因子(h
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bFGF)是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的一员，以其多用途而闻名参与组织的生长和再生，包括伤口的愈合。h
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bFGF激活FGF受体可刺激细胞内信号通路，如磷酸肌醇3
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激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路，这些信号通路与细胞的有丝分裂反应相关。由于h
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bFGF作用于参与创面愈合的各种靶细胞，其对创面愈合的影响已被广泛研究。另外，h
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bFGF促进真皮成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞向伤口部位的迁移，并促进其增殖。因此，h
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bFGF加速了肉芽组织的形成和血管生成，从而导致基质的形成和重塑。近年来，h
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bFGF另一应用作为培养基添加剂已被报道，bFGF在细胞大规模培养领域是胚胎干细胞培养基中的一个重要成分，其作用为使细胞在无血清培养基中保持未分化的状态。然而，其固有的不稳定性和快速降解往往需要频繁的处理和更高的浓度，报道的重组bFGF在正常细胞培养条件下的半衰期小于10h，在生物体中甚至更短，这大大限制了其在体外和体内应用中的生物利用度。因此，采用分子生物技术方法提高h
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bFGF的稳定性将提高其应用范围。在早期的研究中，研究者们通过引入h
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bFGF分子的突变或结构修饰，或利用肝素来保护bFGF，但是这些方法均不能提高h
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bFGF的稳定性及其活性；
[0003]天然的bFGF在组织中含量极微，从组织中提取则成本高、产量低且操作困难，为了解决这个困难，目前均采用基因工程技术和发酵工程技术来制备，以便提高h
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bFGF的产量和活性。但是采用基因工程技术只是引入h
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bFGF分子的突变或结构修饰，或利用肝素来保护h
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bFGF这些效果都不明显，另外，通过发酵工程技术也不能解决h
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bFGF不稳定的缺点且成本高，耗费时间久。

技术实现思路

[0004]本申请的内容部分用于以简要的形式介绍构思，这些构思将在后面的具体实施方式部分被详细描述。本申请的内容部分并不旨在标识要求保护的技术方案的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求的保护的技术方案的范围。
[0005]为了解决以上
技术介绍
部分提到的技术问题，本申请的一些实施例提供了一种rh
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TM
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bFGF基因，其特征在于，该基因序列具有序列表中SEQID：NO.1所示的核苷酸序列。
[0006]一种rh
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TM
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bFGF基因的重组质粒，其特征在于：含rh
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TM
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bFGF基因的重组质粒。
[0007]一种rh
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TM
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bFGF基因的蛋白，其特征在于：含重组质粒的蛋白。
[0008]重组质粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0009]获取h
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bFGF基因序列和TM基因序列，并将h
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bFGF基因序列与TM基因序列融合获得rh
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TM
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bFGF的基因序列；
[0010]获取pET
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28a质粒，并以pET
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28a质粒作为载体，将rh
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TM
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bFGF的基因通过PCR技术插入到pET
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28a质粒中，获得重组质粒。
[0011]蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0012]将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，得到转化产物；
[0013]对转化产物进行蛋白诱导，得到诱导产物；
[0014]对诱导产物进行蛋白纯化，并收集纯化后的纯化产物，纯化产物为蛋白；
[0015]对蛋白进行检测，验证蛋白的表达情况。
[0016]进一步地，
[0017]将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，得到转化产物的步骤包括：
[0018]将BL21感受态细胞置于冰上，然后加入重组质粒，冰上静置一段时间；
[0019]置于金属浴42℃中，热激50s；
[0020]冰上静置5min，加入LB液体培养基，培养一段时间；
[0021]将菌液涂布于LB固体培养基平板；
[0022]将平板倒置于37℃培养箱内培养一段时间后得到转化产物。
[0023]进一步地，
[0024]对转化产物进行蛋白诱导，得到诱导产物的步骤包括；
[0025]在LB液体培养基中加0.1％50μg/mL卡那kana抗生素，挑取单菌落，混匀置于37℃220rpm摇床中培养12h；
[0026]在LB液体培养基中加入0.1％50μg/mL卡那kana抗生素，再加入1.0％的过夜培养的菌液，置于37℃、220rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定OD600值为0.4
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0.6后，加入诱导剂IPTG诱导，诱导条件为低温16℃、220rpm诱导24h；
[0027]将诱导过的菌液，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体；离心菌体加入Buffer A缓冲溶液充分吹打混匀后再离心13000rpm，10min，4℃，保留沉淀；
[0028]在沉淀中加入Buffer A缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中，利用超声破碎机在超声强度为80％的条件下，每次间隔7s持续超声破碎3s，直至溶液呈半透明状态；离心13000rpm，4℃，30min后，弃去沉淀保留上清溶液，得到诱导产物。
[0029]rh
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TM
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bFGF基因在促进胰岛素分泌细胞的增殖和分化，从而增加胰岛素的分泌，改善胰岛素抵抗和糖代谢紊乱的应用和\或在促进肝细胞的增殖和分化，从而促进肝组织的修复和再生，减轻肝损伤的程度和缩短恢复时间的应用和\或在皮肤修复方面的应用。
[0030]本申请的有益效果在于：
[0031]采用基因工程的方法通过大肠杆菌表达rh
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TM
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bFGF，提高了其表达量，节约时间、成本低，且纯化容易；
[0032]提出了一种新型重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh
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TM
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bFGF)刚好能解决这些问题，新型rh
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TM
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种rh
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TM
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bFGF基因，其特征在于，该基因序列具有序列表中SEQID：NO.1所示的核苷酸序列。2.一种rh
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TM
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bFGF基因的重组质粒，其特征在于：含权利要求1所述的rh
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TM
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bFGF基因的重组质粒。3.一种rh
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TM
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bFGF基因的蛋白，其特征在于：含权利要求2所述的重组质粒的蛋白。4.如权利要求2所述的重组质粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：获取h
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bFGF基因序列和TM基因序列，并将h
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bFGF基因序列与TM基因序列融合获得rh
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TM
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bFGF的基因序列；获取pET
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28a质粒，并以pET
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28a质粒作为载体，将rh
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TM
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bFGF的基因通过PCR技术插入到pET
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28a质粒中，获得重组质粒。5.如权利要求3所述的蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，得到转化产物；对转化产物进行蛋白诱导，得到诱导产物；对诱导产物进行蛋白纯化，并收集纯化后的纯化产物，纯化产物为蛋白；对蛋白进行检测，验证蛋白的表达情况。6.根据权利要求5所述的蛋白的制备方法，其特征在于：将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，得到转化产物的步骤包括：将BL21感...

【专利技术属性】
技术研发人员：高振飞，钱永常，殷利红，来灿钢，
申请(专利权)人：杭州纽龙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：