由甘油生成1,3-二羟基丙酮的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了由甘油生成1,3

【技术实现步骤摘要】
由甘油生成1,3
‑
二羟基丙酮的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及由甘油生成1,3
‑
二羟基丙酮的方法及其应用。

技术介绍

[0002]1,3二羟基丙酮(1,3
‑
dihydroxyacetone)，又名二羟基丙酮，简称1,3
‑
二羟基丙酮，属于多羟基酮糖，是自然界存在的最简单的三碳酮糖，在医药、化工、食品、化妆品等领域用途比较广泛。一方面可用作化妆品的原料，对皮肤具有很好的保护作用，另一方面也可以以其为基础合成聚酯类化合物。此外，1,3
‑
二羟基丙酮还是重要的代谢中间产物，通过微生物发酵法可以将其进一步转化为一些高附加值化学品和燃料分子，如乙醇、丁醇、乳酸、琥珀酸等，还可以合成其他具有更高价值的糖类，如赤藓酮糖，山梨糖等。所以1,3
‑
二羟基丙酮是一个重要的化学合成中间体，广泛应用于化妆品制造、食品研制、医药和化学合成等行业。
[0003]1,3
‑
二羟基丙酮的生产方法主要包括化学合成法和生物合成法。化学合成法存在原料成本高，反应条件苛刻、设备要求高、产品回收率低以及污染环境等问题，其应用受到一定限制，生物转化法的优势在于反应条件温和、反应专一性强、环境污染小、底物利用率高等特点。目前1,3
‑
二羟基丙酮的合成方法主要有三种。1.以甘油为底物，在甘油脱氢酶的作用下经过脱氢生成1,3
‑
二羟基丙酮。微生物中通常含有三种类型的甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenases，GDH)：(1)依赖于NAD
+
的GDH(EC 1.1.1.6)，主要存在于细胞质中，先将甘油转化为1,3
‑
二羟基丙酮，1,3
‑
二羟基丙酮进一步磷酸化，进入糖酵解和三羧酸循环途径。(2)依赖于NADP
+
的GDH(EC 1.1.1.72和EC 1.1.1.156)，多存在于霉菌和动物组织中，可将甘油氧化为甘油醛或1,3
‑
二羟基丙酮。(3)既不依赖于NAD
+
，也不依赖于NADP
+
的GDH(EC 1.1.99.22)，该酶位于葡萄糖酸杆菌属的细胞膜上。2.以甲醇为底物，在二羟基丙酮合成酶的作用下形成1,3
‑
二羟基丙酮；3.以果糖为底物转化得1,3
‑
二羟基丙酮。
[0004]由于补料间歇工艺和下游加工的成本相当高，以甘油为底物通过微生物发酵，在胞内甘油脱氢酶的作用下氧化甘油生成1,3
‑
二羟基丙酮，生产1,3
‑
二羟基丙酮的成本相对较高。因此胞外酶催化有望成为利用微生物生产1,3
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二羟基丙酮的良好替代品。
[0005]然而，大多数由脱氢酶催化的氧化反应通常需要NAD(P)
+
作为辅因子，为了经济地进行生物催化反应，有效的辅因子再生策略至关重要。目前，已经开发了几种用于辅因子再生的方法，包括光催化、化学、电化学和酶法。在这些方法中，酶法途径是最有吸引力的，因为它们是高度特异性和生态友好的特点。NADH氧化酶(NADH oxidase，Nox)通过双电子还原将分子O2还原成H2O2或通过四电子还原成H2O来催化NADH的氧化，它能够使用溶解氧作为底物，并且在水溶液中不产生副产物，是NAD
+
再生的候选酶。在目前的工作中，两种相关的共因子循环酶，Nox和GDH被表征。即使在较低浓度的可利用的NAD
+
下，增加GDH也能促进NAD
+
向NADH的转化，这使得在混合固定化酶催化反应中连续供应NADH成为可能。
[0006]尽管由于产物抑制，甘油的转化率仍然很低，但Nox的高效NAD
+
循环使其成为工业
应用于混合脱氢酶催化氧化的有吸引力的生物催化剂。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种由甘油生成1,3
‑
二羟基丙酮的方法及其应用。
[0008]第一方面，本专利技术要求保护一种由甘油生成1,3
‑
二羟基丙酮的方法。
[0009]本专利技术要求保护的由甘油生成1,3
‑
二羟基丙酮的方法，可包括如下步骤：在甘油转化蛋白、NADH转化蛋白、NAD
+
存在下，底物甘油发生氧化反应生成1,3
‑
二羟基丙酮。
[0010]其中，所述甘油转化蛋白为来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的甘油脱氢酶GldA。所述NADH转化蛋白为来源于戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)的NADH氧化酶LpNox或来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的NADH氧化酶变体SpNox
‑
K184R；所述SpNox
‑
K184R为将来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的NADH氧化酶SpNox的第184氨基酸残基由K突变为R后得到的变体。
[0011]进一步地，在所述方法的反应体系中，甘油的初始浓度可为0
‑
1000mM(不含0点；如100mM或200mM)、NAD
+
的初始浓度可为0
‑
20mM(不含0点；如2mM)、所述GldA的初始浓度可为0
‑
2420U/mL(不含0点；如242U/mL)、所述LpNox或所述SpNox
‑
K184R的初始浓度可为0
‑
2420U/mL(不含0点；如242U/mL)。
[0012]进一步地，在所述反应体系中，除了甘油、NAD
+
、所述GldA、所述LpNox或所述SpNox
‑
K184R外，余量可为pH6
‑
8的近中性的缓冲液，如pH7.1的300mM磷酸钾缓冲液。
[0013]在所述方法的反应体系中，由于构建了辅酶循环体系，因此在初始添加NAD
+
之后的反应过程中无需再次外源添加NAD
+
就能实现高产1,3
‑
二羟基丙酮。
[0014]进一步地，所述方法中的反应可为：在酶可催化温度20
‑
40℃(如30℃)下反应。反应时间最好是10h以上(如10
‑
50h，具体如14h)。
[0015]在本专利技术的具体实施方式中，所述GldA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述LpNox的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述SpNox
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K184R的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0016]第二方面，本专利技术要求保护一种由甘油生成乳酸的方法。
[0017本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由甘油生成1,3
‑
二羟基丙酮的方法，包括如下步骤：在甘油转化蛋白、NADH转化蛋白、NAD
+
存在下，底物甘油发生氧化反应生成1,3
‑
二羟基丙酮；所述甘油转化蛋白为来源于大肠杆菌的甘油脱氢酶GldA；所述NADH转化蛋白为来源于戊糖乳杆菌的NADH氧化酶LpNox或来源于化脓性链球菌的NADH氧化酶变体SpNox
‑
K184R；所述SpNox
‑
K184R为将来源于化脓性链球菌的NADH氧化酶SpNox的第184氨基酸残基由K突变为R后得到的变体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述方法的反应体系中，甘油的初始浓度为0
‑
1000mM(不含0点)、NAD
+
的初始浓度为0
‑
20mM(不含0点)、所述GldA的初始浓度为0
‑
2420U/mL(不含0点)、所述LpNox或所述SpNox
‑
K184R的初始浓度为0
‑
2420U/mL(不含0点)。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反应体系中，除了甘油、NAD
+
、所述GldA、所述LpNox或所述SpNox
‑
K184R外，余量为pH6
‑
8的缓冲液。4.根据权利要求1
‑
3中任一所述的方法，其特征在于：在所述方法的反应体系中，无需再次外源添加NAD
+
。5.根据权利要求1
‑
4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中的反应是在20
‑
40℃下进行。6.根据权利要求1
‑
5中任一所述的方法，其特征在于：所述GldA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；和/或所述LpNox的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；和/或所述SpNox
‑
K184R的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。7.一种由甘油生成乳酸的方法，包括如下步骤：(A1)利用权利要求1
‑
6中任一所述方法，以甘油为底物制备得到1,3
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二羟基丙酮；(A2)利用碱金属氢氧化物和/或碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱蕾蕾，马越，李天真，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：