BsALS作为催化剂在合成邻羟基酮类化合物及N-芳基异羟肟酸方面的用途制造技术

本发明专利技术通过研究及实验分析，明确了BsALS在合成邻羟基酮类化合物及N

【技术实现步骤摘要】
BsALS作为催化剂在合成邻羟基酮类化合物及N
‑
芳基异羟肟酸方面的用途


[0001]本专利技术属于生物工程和药学领域，具体涉及一种特定细菌乙酰乳酸合酶作为催化剂在生物转化法合成工艺的新用途。

技术介绍

[0002]手性的α
‑
羟基酮不论在药物合成方面还是有机合成领域都是非常重要的反应中间体，如通过酶催化法合成的(R)
‑
苯基乙酰基甲醇((R)
‑
PAC)经过进一步的酶促转胺等反应，可以得到光学纯度较高的麻黄碱、去甲麻黄碱，而这些生物碱都具有较高的医用和药用价值。另外，R
‑
对硝基苯基乙酰基甲醇也是合成重要的抗生素
‑
氯霉素的中间体，由(1R,2S)去甲麻黄碱衍生的(1R,2S)
‑
N
‑
吡咯烷基去甲麻黄碱则是合成一线抗HIV药物依法伟伦的重要手性配体。
[0003]手性的α
‑
羟基酮目前主要是通过有机合成方法和生物转化途径获得，有机合成途径需要较多的反应步骤，而且对反应要求比较苛刻，最后还需要对产物进行手性拆分，费时费力，很难应用于大规模生产；生物转化法所需要的反应步骤较少，反应条件也相对温和，最重要的是产物的光学纯度很高，有的酶促反应产物的ee值>99％。因此生物转化法合成(R)
‑
PAC及类似物及其他手性药物的中间体已成为了相关领域的研究热点。
[0004]乙酰乳酸合酶(ALS)存在于有限数量的细菌种类中，包括芽孢杆菌、某些乳酸菌(乳球菌和葡萄珠菌)以及肠道细菌，如肠杆菌、克雷伯氏菌和沙雷氏菌等等。它是微生物发酵过程中合成平台化合物乙偶姻白和2,3
‑
丁二醇的关键酶之一。这种酶是一种同源四聚体，属于磷酸硫胺素(ThDP)依赖酶家族。早先的研究表明，ALS对底物具有严格的特异性，仅能催化两分子丙酮酸缩合生成乙酰乳酸，而未见利用2
‑
丁酮酸为其底物。专利技术人此前的研究发现(见论文《枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶催化条件优化与功能鉴定》)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ALS(BsALS)蛋白不仅催化两分子丙酮酸缩合生成乙酰乳酸，而且还可以同时利用丙酮酸和2
‑
丁酮酸为底物生成乙酰乳酸及2
‑
乙酰基
‑2‑
羟基丁酸；同时，它甚至可以利用丙酮酸为供体底物，苯甲醛为受体底物反应生成乙酰基苯基甲醇。
[0005]在继续深入的研究中，专利技术人最新实验发现，BsALS具有更加宽泛的底物谱，以不同的供体底物和受体底物合成新的产物。基于这些新的研究成果，提出了本专利技术专利申请。

技术实现思路

[0006]本专利技术明确了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)乙酰乳酸合酶(BsALS)作为催化剂在合成邻羟基酮类化合物及N
‑
芳基异羟肟酸方面的用途；其中，所述邻羟基酮类化合物包括(R)
‑
芳基丙酰基甲醇、(R)
‑
苯乙烯基丙酰基甲醇及其类似物。具体是：
[0007]以2
‑
丁酮酸为供体底物，芳香基甲醛及其类似物为受体底物合成了一系列高光学纯度的(R)
‑
芳基丙酰基甲醇；
[0008]以2
‑
丁酮酸为供体底物，肉桂醛及其类似物为受体底物，合成了一系列(R)
‑
苯乙
烯基丙酰基甲醇类化合物及其类似物；
[0009]以丙酮酸或2
‑
丁酮酸为供体底物，芳基亚硝基化合物为受体底物合成了一系列N
‑
芳基异羟肟酸。
[0010]以上三大类合成反应机理有共同之处。
[0011]第一类，合成(R)
‑
芳基丙酰基甲醇的方法，具体包括以下步骤：
[0012]在1.0
‑
3.0mL反应混合物中含有20
‑
80mM供体底物2
‑
丁酮酸、10
‑
40mM受体底物芳基甲醛、50
‑
100mM(pH 7.0
‑
8.5)的HEPES或PBS或Tris
‑
HCl缓冲液、0.1
‑
5mM ThPP、1
‑
10mM MgCl2、50
‑
100mM KCl、0.25
‑
2.0mM DTT、以及1
‑
20％DMSO；
[0013]以上反应混合物在20
‑
45℃预孵育3
‑
10min后，加入0.5
‑
1.5mg BsALS引发反应并在同样的温度下继续孵育0.5
‑
3小时；
[0014]离心收集上清液，用氯仿或乙酸乙酯萃取(1～3mL
×
3)，有机相合并后以无水MgSO4或无水Na2SO4干燥，过滤除去固形物，滤液于35
‑
50℃下减压蒸干，所得残余物用硅胶柱进行纯化，洗脱剂为石油醚
‑
乙酸乙酯(V/V,3:1～1:3)。
[0015]第二类，合成(R)
‑
苯乙烯基丙酰基甲醇及其类似物的方法，具体包括以下步骤：
[0016]在1.0
‑
3.0mL反应混合物中含有20
‑
80mM供体底物2
‑
丁酮酸、10
‑
40mM受体底物未取代或常见取代基取代的肉桂醛、50
‑
100mM(pH 7.0
‑
8.5)的HEPES或PBS或Tris
‑
HCl缓冲液、0.1
‑
5mM ThPP、1
‑
10mM MgCl2、50
‑
100mM KCl、0.25
‑
2.0mM DTT、以及1
‑
20％DMSO；
[0017]以上反应混合物在20
‑
45℃预孵育3
‑
10min后，加入0.5
‑
1.5mg BsALS引发反应并在同样的温度下继续孵育0.5
‑
3小时；
[0018]离心收集上清液，用氯仿或乙酸乙酯萃取(1～3mL
×
3)，有机相合并后以无水MgSO4或无水Na2SO4干燥，过滤除去固形物，滤液于35
‑
50℃下减压蒸干，所得残余物用硅胶柱进行纯化，洗脱剂为石油醚
‑
乙酸乙酯(V/V,3:1～1:3)。
[0019]第三类，合成N
‑
苯基异羟肟酸的方法，具体包括以下步骤：
[0020]在1.0
‑
3.0mL反应混合物中含有20
‑
80mM供体底物丙酮酸或2
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.BsALS作为催化剂在合成邻羟基酮类化合物及N
‑
芳基异羟肟酸方面的用途；其中，所述邻羟基酮类化合物包括(R)
‑
芳基丙酰基甲醇、(R)
‑
苯乙烯基丙酰基甲醇及其类似物。2.权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途是以2
‑
丁酮酸为供体底物、芳基甲醛为受体底物，立体选择性地合成(R)
‑
芳基丙酰基甲醇；所述芳基甲醛中的芳基为未取代的以及常见取代基取代的苯基、萘基、吡啶基、吲哚基、喹啉基中的任意一种，所述常见取代基包括烷基、羟基、甲氧基、硝基、氨基、N,N
‑
二甲基、甲砜基、卤素；所述(R)
‑
芳基丙酰基甲醇为具有以下通式I的任意一种化合物：其中，R1为所述芳基甲醛中的芳基。3.权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途是以2
‑
丁酮酸为供体底物，未取代的或常见取代基取代的肉桂醛为受体底物，立体选择性地合成(R)
‑
苯乙烯基丙酰基甲醇及其类似物，所述常见取代基包括烷基、羟基、甲氧基、硝基、氨基、N,N
‑
二甲基、甲砜基、卤素；所述(R)
‑
苯乙烯基丙酰基甲醇及其类似物为具有以下通式II的任意一种化合物：其中，R2为未取代的或所述常见取代基取代的苯乙烯基。4.权利要求1所述的用途，其特征在于：所述用途是以丙酮酸或2
‑
丁酮酸为供体底物、未取代的或常见取代基取代的芳基亚硝基化合物为受体底物，合成N
‑
芳基异羟肟酸，所述常见取代基包括烷基、羟基、甲氧基、硝基、氨基、卤素；所述N
‑
芳基异羟肟酸为具有以下通式III的任意一种化合物：其中，R3为未取代的或所述常见取代基取代的芳基；R4为甲基或乙基。5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，合成(R)
‑
芳基丙酰基甲醇的方法包括：在1.0
‑
3.0mL反应混合物中含有20
‑
80mM供体底物2
‑
丁酮酸、10
‑
40mM受体底物芳基甲醛、50
‑
100mM的HEPES或PBS或Tris
‑
HCl缓冲液、0.1
‑
5mMThPP、1
‑
10mM MgCl2、50
‑
100mMKCl、0.25
‑
2.0mMDTT、以及1
‑
20％DMSO；以上反应混合物在20
‑
45℃预孵育3
‑
10min后，加入0.5
‑
1.5mgBsALS引发反应并在同样的温度下继续孵育0.5
‑
3小时；离心收集上清液，用氯仿或乙酸乙酯萃取，有机相合并后以无水MgSO4或无水Na2S...

【专利技术属性】
技术研发人员：高文运，李恒，靳国斐，赵亚梅，郑佩蓉，刘智文，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：