一种抗氧化融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种抗氧化融合蛋白及其制备方法和应用，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列包含以SEQ ID No:1所示的氨基酸序列、和/或与SEQ ID No:1具有至少85%同源性的氨基酸序列。本发明专利技术的抗氧化融合蛋白可用于制备预防和/或治疗缺血缺氧性脑病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、以及皮肤老化的抗氧化应激制剂。以及皮肤老化的抗氧化应激制剂。以及皮肤老化的抗氧化应激制剂。

【技术实现步骤摘要】
一种抗氧化融合蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及抗氧化蛋白的
，尤其是涉及一种抗氧化融合蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，与很多疾病的发生、发展密不可分。大多数原始的无脊椎动物细胞中都存在Cu/Zn
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SOD，脊椎动物则一般含有Cu/Zn
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SOD和Mn
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SOD。人、鼠、猪、牛等红细胞和肝细胞中含Cu/Zn
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SOD，且其主要存在于细胞质，同时也存在于线粒体内外膜之间。而从人和动物肝细胞中也纯化了Mn
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SOD，其一般存在于线粒体基质中。
[0003]皮肤衰老和损伤是人体衰老的重要特征，而人体衰老是由于活性氧类自由基堆积或清除产生障碍的后果，体内的多余自由基会引起细胞损伤以及色素沉着。由于人的皮肤直接与氧气接触，会造成皮肤的老化和损伤。外源SOD的补充有利于延缓皮肤衰老、抗氧化、祛色斑的功用。故国内外许多化妆品厂家都在自身产品中加入了一定比例的SOD。此外，基于SOD是作用于超氧阴离子自由基的专一歧化反应催化剂，故SOD作为医药产品，在治疗因自由基作用而导致的炎症、自身免疫性、心脑血管疾病等都有着显著疗效。SOD可利用其抗氧化作用抑制关节炎、胸膜炎、急性气管炎等炎症类型。
[0004]现有市场上的抗氧化蛋白SOD主要以单功能蛋白为主，不能兼具外用和内用功能、发挥不同的抗氧化活性。同时，抗氧化蛋白细胞穿膜效果差，进入细胞内部发挥抗氧化作用存在一定的局限性。因此，现亟需研发一种具有双重抗氧化功能的抗氧化融合蛋白，发挥不同的抗氧化活性，扩大抗氧化蛋白的适用范围，不但适用于外用(营养皮肤、抗衰防皱等)，还可适用于内用(注射剂)，用于治疗缺血性脑病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病等，抵抗氧化应激引起的机休损伤。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种抗氧化融合蛋白，其用于治疗缺血性脑病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、皮肤老化等，抵抗氧化应激引起的机休损伤。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一种抗氧化融合蛋白的制备方法，其具有步骤简单、产物回收产率高优点。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供一种抗氧化融合蛋白的应用，其用于治疗缺血性脑病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、皮肤老化等，抵抗氧化应激引起的机休损伤。
[0008]为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0009]一种抗氧化融合蛋白，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列包含以SEQ ID No:1所示的氨基酸序列、和/或与SEQ ID No:1具有至少85％同源性的氨基酸序列。
[0010]通过采用上述技术方案，抗氧化融合蛋白(GLS)的氨基酸序列由6
×
his
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rhGrx
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linker
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rhS OD
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15RQ构成，构建序列时，首先，以人超氧化物歧化酶的mRNA序列为模板进行基因构建，通过分析其组成氨基酸的种类、比例和特殊顺序，N端为6
×
his相连的rhGrx，C端为含穿膜肽的SOD，中间用9个Gly作为连接肽(linker)，成为一个抗氧化融合蛋白，其中rhG rx是分布在脑组织中的谷氧还蛋白家族的一个成员，该蛋白在细胞氧化还原稳态、巯基稳态和抗氧化应激的防御中起着至关重要的作用，该蛋白将rhGrx与SOD融合一起，以提高rhS OD序列区段的抗氧化和自由基清除性能，相比于天然SOD，能更快催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢；
[0011]其次，通过自主设计的linker(G9，GGGGGGGGG)，既有一定的柔韧性，又不容易被蛋白酶降解，并能将rhSOD和rhGrx基因融合表达，以使抗氧化融合蛋白能通过催化谷胱甘肽(GSH)与蛋白质二硫键之间进行氧化还原反应，修复蛋白质活性，参与维持细胞的氧化还原状态提供细胞浆内的还原环境，对ROS导致的细胞氧化应激损伤具有阻抗与治疗作用；
[0012]第三，在N
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端添加6
×
His，以方便进行亲和纯化，在C
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端添加了自主设计的穿膜肽序列(RRQRRQRRQRRQRRR，简称15RQ)，可以引导抗氧化融合蛋白穿膜进入细胞内部，起到较好的抗氧化应激作用；
[0013]综上，以使得抗氧化融合蛋白具有治疗缺血性脑病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、皮肤老化等的作用，可以抵抗氧化应激引起的机休损伤。
[0014]进一步地，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列包含以SEQ ID No:1所示的氨基酸序列、和/或与SEQ ID No:1具有至少85％同源性的氨基酸序列的n个重复的序列，n≥1。
[0015]更进一步地，所述n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、24或32，其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的。
[0016]更进一步地，所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No:1具有至少88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
[0017]为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0018]一种抗氧化融合蛋白的制备方法，包括以下步骤，
[0019]S1人工全基因合成所述抗氧化融合蛋白的核苷酸序列SEQ ID No:2，并将其插入到pPIC 9K载体的XhoI和EcoRI限制性酶切位点之间，得到表达载体；
[0020]S2将所述S1得到的表达载体经SalI单酶切线性化后，电转化导入毕赤酵母中，经发酵表达和后处理，得到所述抗氧化融合蛋白。
[0021]通过采用上述技术方案，制备步骤简单，利用上述方法，在每1L发酵液中，能获得产量≥800mg、纯度≥98％的抗氧化融合蛋白。
[0022]进一步地，在所述S2中，所述毕赤酵母细胞为毕赤酵母GS115，毕赤酵母GS115先经过MD平板初步筛选，再将MD平板上长出来的克隆挑到含不同浓度抗生素G418(1～20mg/mL)的YPD平板上进行抗性筛选，最后选取高抗性菌落，利用PCR技术进行鉴定。
[0023]进一步地，在所述S2的发酵表达过程中，控制一级种子液BMGY的用量为1.0～2.0L，二级种子液BMGY的用量为10～20L，发酵培养基为BMMY培养基，发酵容器为300L发酵罐、实际装量为100～200L，接种比例为1：(8～12)，培养温度为25～35℃，诱导剂为1％甲醇，诱导时间为70～75h，用氨水调节pH为5.5～6.5，每隔24h添加补料为8～12L的10％蛋白胨。
[0024]进一步地，在所述S2的后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗氧化融合蛋白，其特征在于：所述抗氧化融合蛋白的氨基酸序列包含以SEQ ID No:1所示的氨基酸序列、和/或与SEQ ID No:1具有至少85%同源性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的一种抗氧化融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，S1人工全基因合成所述抗氧化融合蛋白的核苷酸序列SEQ ID No:2，并将其插入到pPIC9K载体的XhoI和EcoRI限制性酶切位点之间，得到表达载体；S2将所述S1得到的表达载体经SalI单酶切线性化后，电转化导入毕赤酵母中，经发酵表达和后处理，得到所述抗氧化融合蛋白。3.根据权利要求1所述的一种抗氧化融合蛋白在制备预防和/或治疗缺血缺氧性脑病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、以及皮肤老化的抗氧化应激制剂中的应用。4.根据权利要求1所述的一种抗氧化融合蛋白的应用，其特征在于：所述抗氧化应激制剂包括40~60%油相和40~60%水相；其中，所述油相由包含以下重量百分比的原料制成，乳化剂0.5~1.0%，橄榄油0.5~5.0%，维生素E0.05~0.50%，余量为注射用油；所述水相由包含以下重量百分比的原料制成，抗氧化融合蛋白0.1~1.0%，透明质酸钠0.1~2.0%，甘油1~10%，羧甲基纤维素钠0.05~0.50%，余量为注射用水。5.根据权利要求4所述的一种抗氧化融合蛋白的应用，其特征在于：在所述油相中，乳化剂为吐温
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40。6.根据权利要求5所述的一种抗氧化融合蛋白的应用，其特征在于：所述油相还包括，凡士林0.1~1.0%，单硬脂酸甘油酯0.1~1.0%，对羟基苯甲酸甲酯0.05~0.50%。7.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱子晨，蒋路，王敏燕，谢斌，
申请(专利权)人：杭州浦泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：