一种重组人角质细胞生长因子-2及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种重组人角质细胞生长因子

【技术实现步骤摘要】
一种重组人角质细胞生长因子
‑
2及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术的
，尤其是涉及一种重组人角质细胞生长因子
‑
2及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]慢性阻塞性肺病（COPD）是以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，是闭塞性细支气管炎和肺气肿共同作用的结果。COPD是世界范围内严重危害公众健康的主要病种之一，据世卫组织预测，到2030年慢性阻塞性肺病将成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的全世界第三大死因。COPD不仅仅患病率高，而且病程呈进行性发展，可引起劳动力丧失、生活质量减退，最终导致的致残、致死率也很高。目前临床用药主要有以下几类：支气管扩张剂、糖皮质激素、抗生素、其它类（如磷酸二酯酶4抑制剂、抗氧剂）。目前，获批治疗慢性支气管炎引起的COPD化学药物多是单一化学成分，其中绝大多数为支气管扩张剂。然而大多COPD患者都需要更多更有效的药物支持，以改善症状。
[0003]与上述单一化学成分药物相比，肽类药物具有高活性、高特异性、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的优点。但由于肽类药物存在稳定性差、相对分子质量大、不易透过生物膜、在体内易被酶解、降解代谢途径多样等缺点。多肽类药物在临床上主要以注射液和冻干粉针的剂型为主，为了达到疗效常常需要频繁地注射给药，严重影响患者的顺应性。
[0004]在肽类药物中，在肽类药物中，人角质细胞生长因子（KGF
‑
2）又叫做成纤维细胞生长因子
‑
10（ FGF
>‑
10）。在胚胎发育过程中，KGF
‑
2是起始肢芽形成并促进其生长的关键性细胞因子。KGF
‑
2由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸的疏水信号肽，成熟蛋白有169个氨基酸（40
‑
208aa），理论分子量为19.3kDa，KGF
‑
2对酸和热不稳定，对肝素具有较强的亲和作用，其特异性地结合于靶细胞表面的酪氨酸激酶受体FGFR2IIIb （KGFR）、FGFR1而触发信号传导，从而发挥生理作用，刺激上皮细胞再生、分化和迁移。天然的KGF
‑
2稳定较差，活性容易受环境影响，生物半衰期短，在温和的温度下也容易聚合。
[0005]目前，生产人角质细胞生长因子
‑
2（KGF
‑
2）的大肠杆菌发酵方法主要是以包含体形式进行生产，该方法虽然能够形成高产，但是在包含体复性和后续纯化方面会形成复杂繁琐的工艺流程，目标产物KGF
‑
2的产量很低，不足以进行规模化生产。限制了目标蛋白的规模化生产。现有工艺得到的KGF2，其结构通常N端前面多出一个Met甚至多个氨基酸残基，从而具有免疫原性，需工具酶进行进一步酶切，有待改进。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种重组人角质细胞生长因子
‑
2，其具有理化特性和生物学活性高、分子量均一、N端无氨基酸残基、免疫原性低的优点。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供一种重组人角质细胞生长因子
‑
2的制备方法，其解决了现有方法中表达得到的目的蛋白N端多出一个Met甚至多个氨基酸残基、需要加工修饰
的问题，并能获得理化特性和生物学活性高、活性和纯度较高的重组人角质细胞生长因子
‑
2。
[0008]本专利技术的第三个目的在于提供一种重组人角质细胞生长因子
‑
2的应用，其具有良好的产业应用前景。
[0009]为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种重组人角质细胞生长因子
‑
2，其氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。
[0010]为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种重组人角质细胞生长因子
‑
2的制备方法，包括以下步骤，S1人工全基因合成所述重组人角质细胞生长因子
‑
2的核苷酸序列SEQ ID NO:2，并将其插入到pET
‑
28a（+）载体的NcoI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组载体pET
‑
28a（+）
‑
rhKGF
‑
2；S2将所述S1得到的重组载体采用CaCl2方法导入大肠杆菌BL21中，筛选高表达活化的转化子；S3培养所述S2得到的转化子，并诱导表达rhKGF
‑
2，表达完成后经后处理，得到所述重组人角质细胞生长因子
‑
2。
[0011]进一步地，在所述S2中，大肠杆菌为重组大肠杆菌pGFp8（BL21）。
[0012]进一步地，在所述S3中，包括以下步骤，S31先将所述转化子接种于LB培养基上，培养15~17h，再挑选单菌落转化子接种于2L的LB培养基上，控制培养温度为37
±
2℃、摇床转速为220~280rpm，培养19~22h，得到一级种子液；S32先将所述S31得到的一级种子液按照3.5~4.5%的比例接种于50L发酵培养基上，控制培养温度为37
±
2℃、摇床转速为220~280rpm、pH为6.5~7.5，培养至OD
600
为0.7~0.9，得到二级种子液；S33将所述S32得到的二级种子液全部接种于1000L发酵培养基上，控制培养温度为37
±
2℃、摇床转速为220~280rpm、pH为6.5~7.5，培养至OD
600
为0.5~0.7，滴加1mM的IPTG诱导表达rhKGF
‑
2，诱导5~7h，得到发酵液；S34先将所述S33得到的发酵液进行离心处理，控制离心转速为4000~4500rpm、时间为15~25min、温度为3~5℃，再对离心得到的沉淀依次进行高压均质破碎、Heparin纯化、超滤浓缩、SP
‑
Sepharose纯化处理，得到重组人角质细胞生长因子
‑
2。
[0013]进一步地，在所述S34中，高压均质破碎过程包括，先按照 1：20的重量体积比，用大肠杆菌破菌液将离心得到的沉淀均质重悬，然后以800~1200Bar的压力进行高压破菌处理，控制破菌温度在10~20℃，循环2~3次，直至镜检破菌率达到 99%以上，接着进行离心处理，控制离心转速为8000~10000rpm、时间为15~25min、温度为3~5℃，得到破菌上清液。
[0014]进一步地，在所述S34中，Heparin纯化过程包括，先将Heparin 层析柱用上样缓冲液平衡完全用上样缓冲液平衡完全后，将高压均质破碎得到的破菌上清液按照 4~6mL/min的流速上样，上样峰下来后继续用上样缓冲液清洗至基线平，清洗后将洗脱缓冲液浓度从 0~100%冲洗 10CV，收集主样品峰，然后用100%浓度的洗脱缓冲液洗脱，混合洗脱样品，得到一级纯化液。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人角质细胞生长因子
‑
2，其特征在于：所述重组人角质细胞生长因子
‑
2的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。2.根据权利要求1所述的一种重组人角质细胞生长因子
‑
2的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，S1人工全基因合成所述重组人角质细胞生长因子
‑
2的核苷酸序列SEQ ID NO:2，并将其插入到pET
‑
28a（+）载体的NcoI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组载体pET
‑
28a（+）
‑
rhKGF
‑
2；S2将所述S1得到的重组载体导入大肠杆菌BL21中，筛选高表达活化的转化子；S3培养所述S2得到的转化子，并诱导表达rhKGF
‑
2，表达完成后经后处理，得到所述重组人角质细胞生长因子
‑
2。3.根据权利要求1所述的一种重组人角质细胞生长因子
‑
2的制备方法，在所述S2中，大肠杆菌为重组大肠杆菌pGFp8（BL21）。4.根据权利要求1所述的一种重组人角质细胞生长因子
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2的制备方法，在所述S3中，包括以下步骤，S31先将所述转化子接种于LB培养基上，培养15~17h，再挑选单菌落转化子接种于2L的LB培养基上，控制培养温度为37
±
2℃、摇床转速为220~280rpm，培养19~22h，得到一级种子液；S32先将所述S31得到的一级种子液按照3.5~4.5%的比例接种于50L发酵培养基上，控制培养温度为37
±
2℃、摇床转速为220~280rpm、pH为6.5~7.5，培养至OD
600
为0.7~0.9，得到二级种子液；S33将所述S32得到的二级种子液全部接种于1000L发酵培养基上，控制培养温度为37
±
2℃、摇床转速为220~280rpm、pH为6.5~7.5，培养至OD
600
为0.5~0.7，滴加1mM的IPTG诱导表达rhKGF
‑
2，诱导5~7h，得到发酵液；S34先将所述S33得到的发酵液进行离心处理，控制离心转速为4000~4500rpm、时间为15~25min、温度为3~5℃，再对离心得到的沉淀依次进行高压均质破碎、Hepar...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱子晨，蒋路，谢斌，王敏燕，
申请(专利权)人：杭州浦泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：