【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种利用毕赤酵母高效表达重组羧肽酶b的制备方法。
技术介绍
1、羧肽酶b(carboxypeptidase b，简称cpb，ec 3.4.17.2)是一类含有锌离子的金属酶，能够特异性地切除蛋白或多肽c末端的碱性氨基酸，尤其是精氨酸和赖氨酸。羧肽酶b的应用范围十分广泛，主要用于科研、医学诊断和药物生产。
2、目前制备活性cpb的方法主要有两类：一类是从猪或牛的胰腺中直接提取并活化获得，但得到的cpb不仅产量低、成本高，并且存在外源病毒等污染，因此应用有限；另一类是在原核生物如大肠杆菌表达系统通过基因重组的方法制备cpb。但是利用大肠杆菌生产的重组羧肽酶b易于形成包涵体，必须经过变性、复性才能得到活性蛋白，操作繁琐、复性效率低，产物的比活性低，存在内毒素污染。并且，现有技术一般是采用胰蛋白酶进行切除cpb原的n端前导肽来获得cpb，存在胰酶的切点专一性不够、后续纯化困难等问题。
3、因此，有必要开发一种表达效率高、方便酶切、分离纯化，更易于实现工业化生产的重组羧肽酶b的制备方法。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种利用毕赤酵母高效分泌表达重组羧肽酶b的制备方法，该方法在蛋白n端第95个氨基酸位置处设计有ek酶位点(ddddk)，采用his-tag亲和层析、ek酶定点切割前导肽，前导肽的酶切专一性强，产物分离纯化工艺简便，目标蛋白回收效率高，产物的酶活力较高。
2、因此，本专利
3、
4、本专利技术的第二方面，是提供了一种利用毕赤酵母高效分泌表达重组羧肽酶b的制备方法，包括如下的步骤：
5、(1)将编码蛋白结构为a-b-c-d的基因序列克隆到表达载体上，并转化导入酵母菌中，经筛选得到重组基因工程菌；其中a表示6*his，b表示前导肽，c为ddddk，d为羧肽酶b；
6、(2)高密度发酵重组酵母菌，诱导表达后离心收集发酵上清液；
7、(3)上清液经过镍离子亲和层析柱，收集目标峰洗脱液；
8、(4)使用肠激酶酶切洗脱液中的目标蛋白，再一次通过镍柱亲和层析收集穿透液，超滤浓缩得到重组羧肽酶b。
9、在本专利技术另一优选的实施方案中，所述方法中的羧肽酶b为重组猪羧肽酶b、重组牛羧肽酶b或重组人羧肽酶b等。在本专利技术另一个优选的实施方案中，所述的羧肽酶b为重组牛羧肽酶b。
10、在另一实施方案中，所述方法步骤(1)中，蛋白结构为a-b-c-d的氨基酸序列如seqid no：2所示，其中n端含有6个his(a)，ddddk为肠激酶位点(c)，his-tag和肠激酶切位点间的序列为前导肽(b)，ddddk之后的序列为牛羧肽酶b(d)：
11、
12、表达后的蛋白为羧肽酶原，经肠激酶切去n端104个氨基酸后，激活成为羧肽酶b(氨基酸为307个，分子量为：34.912kd)，氨基酸序列如seq id n0：3所示：
13、
14、为提高表达效率，对编码蛋白结构为a-b-c-d的基因序列进行密码子优化，获得在毕赤酵母中表达的最优密码子序列，如seq id no：1所示。
15、在本专利技术另一优选的实施方案中，构建好a-b-c-d结构的基因(其序列如seqidno：1所示)后，可用本领域公知的方法将其克隆到各种酵母表达载体如ppicz-α-a，phil-d2，ppic9和phil-s1(invitrogen corp.san diego.california.usa)等中去。所用标准的分子克隆过程见j.萨姆布鲁克等(j.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。表达目标蛋白的宿主优选为酵母菌，如酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母等，更优选为毕赤酵母。目标蛋白表达后可以从宿主中分泌出来。优选的方法是将编码本专利技术中的目标酶的核酸克隆至酵母表达载体ppicz-α-a，电转化，并通过zeocin抗性筛选，获得最高抗性达1mg/ml zeocin的重组表达菌株。
16、在本专利技术一个优选的实施方案中，将构建完成的基因工程酵母菌进行液体培养和发酵，通过甲醇诱导表达目标蛋白。为了让酵母菌适应甲醇，可以分阶段逐步调高甲醇的补料速度，诱导目标蛋白的表达，本专利技术中表达产量可达1.2g/l发酵液。当发酵液菌od600值≥300时，将发酵液放出，离心收集发酵上清。发酵液上清可以先进行超滤或稀释预处理，优选发酵液上清用纯化用水稀释后再上样。
17、在本专利技术另一优选的实施方案中，所述方法步骤(3)中的上清液经过镍柱，利用his-tag亲和层析，平衡液为：0.1-1m nacl+5-100mm tris-hcl ph6.0-8.0溶液，洗脱液采用0.1-1m咪唑+0.1-1m nacl+5-100mm tris-hcl ph6.0-8.0溶液。在另一实施方案中，所述方法步骤(3)收集的洗脱液可进一步进行超滤脱盐。在更为优选的实施方案中，所述方法步骤(3)中的上清液经过镍柱，利用his-tag亲和层析，平衡液为：0.5m nacl-20mm tris-hclph8.0溶液，洗脱液采用0.4m咪唑-0.5m nacl-20mm tris-hcl ph8.0溶液。
18、在本专利技术另一优选的实施方案中，所述方法步骤(4)中，由于目标蛋白n端设计了ddddk位点，可使用肠激酶(ek)进行特异性切割前导肽，活化酶原。由于ek切割时，可在ph值4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物，适用范围广，切割效率高。由于所用的肠激酶也带有his-tag，在切割完成后可以继续重复步骤(3)的步骤，通过镍柱亲和层析收集穿透液，超滤浓缩得到重组羧肽酶b。新工艺步骤简洁，纯化收率高，且纯度、活性有显著的提高(目标蛋白的总回收率达43％，纯度可达95％以上)。
19、在本专利技术另一优选的实施方案中，所述方法步骤(4)中获得的超滤浓缩液可按照常规冷冻干燥程序得到冻干粉，即为重组羧肽酶b。在另一优选的实施方案中，测定制备得到牛羧肽酶b的酶活，结果牛羧肽酶b活力≥200u/mg。
20、本专利技术的技术方案通过密码子优化和毕赤酵母分泌表达羧肽酶b酶原，表达产量高达1.2g/l发酵液。由于羧肽酶b的n端设计有ek酶位点，通过ek酶定点切割前导肽后，采用his-tag亲和层析一步层析即可去除ek酶和前导肽，新工艺步骤简洁，目标蛋白的总回收率达43％，纯度可达95％以上，且活性有显著的提高，相对于现有工艺具有明显的技术优势。
21、本专利技术提供了一种利用毕赤酵母高效表达重组羧肽酶b的制备方法。兹将本专利技术的技术方案总结如下：
22、1、密码子优化后的牛源羧肽酶b酶原本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.密码子优化后的牛源羧肽酶B酶原基因，其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种利用毕赤酵母高效分泌表达重组羧肽酶B的制备方法，包括如下的步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法中的羧肽酶B为重组猪羧肽酶B、重组牛羧肽酶B或重组人羧肽酶B。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法中步骤(1)中，为提高表达效率，对编码蛋白结构为A-B-C-D的基因序列进行密码子优化，获得在毕赤酵母中表达的最优密码子序列，如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，将构建好A-B-C-D结构的基因克隆到酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9或pHIL-S1中去。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，表达目标蛋白的宿主为酵母菌，选自酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(3)中的上清液经过镍柱，利用His-tag亲和层析，平衡液为：0.1-1M NaCl+5-100mM Tris-HCl pH6.0-8.0溶液，洗脱液采用0.1-1M咪唑+0.1-1M NaCl+5-100mM Tris-HCl pH6.0-8.0溶液。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(4)，EK切割时可在pH值4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(4)中获得的超滤浓缩液可按照常规冷冻干燥程序得到冻干粉，即为重组羧肽酶B。
...【技术特征摘要】
1.密码子优化后的牛源羧肽酶b酶原基因，其序列如seq id no:1所示。
2.一种利用毕赤酵母高效分泌表达重组羧肽酶b的制备方法，包括如下的步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法中的羧肽酶b为重组猪羧肽酶b、重组牛羧肽酶b或重组人羧肽酶b。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法中步骤(1)中，为提高表达效率，对编码蛋白结构为a-b-c-d的基因序列进行密码子优化，获得在毕赤酵母中表达的最优密码子序列，如seq id no:1所示。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，将构建好a-b-c-d结构的基因克隆到酵母表达载体ppicz-α-a，phil-d2，ppic9或phil-s1中去。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述方法步骤(1)中，表达目标蛋白的宿主为酵母菌，选自酿酒酵母、毕赤酵母、念珠菌属酵母、汉...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋路，邵国梁，徐登基，张婷，谢斌，
申请(专利权)人：杭州浦泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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