一种重组人超氧化物歧化酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种重组人超氧化物歧化酶及其制备方法和应用。一种重组人超氧化物歧化酶，所述重组人超氧化物歧化酶的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1；一种重组人超氧化物歧化酶的制备方法，包括制备重组载体、基因重组并筛选高抗性转化子、诱导表达rhSOD；一种重组人超氧化物歧化酶在制备抗氧化制剂中的应用，所述抗氧化制剂为用于清除自由基、并抑制促炎细胞因子IL

【技术实现步骤摘要】
一种重组人超氧化物歧化酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及超氧化物歧化酶的
，尤其是涉及一种重组人超氧化物歧化酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]为了清楚机体内的氧自由基，减少其对基体的损害，恢复基体健康，常通过抗氧化剂来清除体内有害的氧自由基。现有的抗氧化剂包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH
‑
PX)、过氧化氢酶(CAT)和单胺氧化酶抑制剂等。其中，超氧化物歧化酶（SOD）是目前常用的酶性抗氧化剂，其具有抗氧化、防衰老、抗炎、防辐射三大功能，可广泛用于化妆品、保健品、食品、医疗等领域。
[0003]目前国内生产的SOD主要从天然生物体中提取，由于人血来源困难，而不宜推广使用。为此，授权公告号为CN103272223B的中国专利公开了一种抗氧化保健胶囊及其制备方法，以300g计，由以下组分制成的胶囊剂：20~30g的80wt%的人参皂苷粉、0.8~1.5g的牛血提取物SOD、15~25g的维生素C、25~35g的维生素E粉与余量的填充物。上述抗氧化剂中的SOD主要来源于牛血，能起到与人血制品SOD相似的抗氧化作用，但是非人源制品SOD用于人体有排异性，且和人血制品SOD都存在外源感染的风险，在各领域中应用受限。此外，天然SOD作为一种功能蛋白，具有药效高、刺激性小、毒性低、高活性、特异性强等优点，但蛋白质类药物的口服给药会在胃肠道发生降解，且胃肠黏膜的穿透性差、分子量大、制备困难、且存在抗原性，有待改进。
[0004]因此，如何研发出一种兼具抗氧化性能和细胞穿膜性能的重组人超氧化物歧化酶，并拓展其在抗氧化制剂中的应用领域，是目前亟需解决的问题。此外，还需设计一种制备重组人超氧化物歧化酶的方法，以提高其产率。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种重组人超氧化物歧化酶，其具有兼具抗氧化性能和细胞穿膜性能的优点。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一种重组人超氧化物歧化酶的制备方法，其具有毕赤酵母体外高效分泌表达、产率高的优点。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供一种重组人超氧化物歧化酶的应用，其达到了拓展其在抗氧化制剂中的应用领域的目的。
[0008]为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种重组人超氧化物歧化酶，所述重组人超氧化物歧化酶的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。
[0009]通过采用上述技术方案，将人Cu/Zn
‑
SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Thr密码子（二者均为亲水性中性氨基酸），保留第6位和57位的半胱氨酸，不影响其活性，但突变Cys111后可以防止二硫键的错配，以提高其空间结构的稳定性；根据毕赤酵母密码
子偏爱性，对SOD基因密码子进行了优化，并且在N
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端添加6
×
His， 以方便进行亲和纯化，在C
‑
端添加了自主设计的穿膜肽序列（RRQRRQRRQRRQRRR，简称15RQ），可以引导SOD穿膜进入细胞内部。
[0010]为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种重组人超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤，S1人工全基因合成所述重组人超氧化物歧化酶的核苷酸序列SEQ ID NO:2，并将其插入到pPICZαA载体的EcoRI和XbaI限制性酶切位点之间，得到重组载体pPICZαA
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rhSOD；S2将所述S1得到的重组载体线性化后导入毕赤酵母中，筛选高抗性转化子；S3培养所述S2得到的转化子，并诱导表达rhSOD，表达完成后经后处理，得到所述重组人超氧化物歧化酶。
[0011]通过采用上述技术方案，本专利技术采用重组工程菌表达生产人源SOD，并将人工设计的穿膜肽15RQ（RRQRRQRRQRRQRRR）与SOD相连，所得产品分子量均一、结构稳定，采用毕赤酵母体外高效分泌表达，rhSOD产率高，且解决了人源SOD来源困难和血制品有外源感染的危险性的难题。
[0012]进一步地，在所述S3中，诱导表达的温度为20~37℃，优选为20、25、30、37℃。
[0013]进一步地，在所述S3中，后处理包括采用Ni
‑
NTA亲和层析、超滤脱盐、调节pH、阳离子交换层析（SP
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Sepharose FF）。
[0014]为实现上述第三个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种重组人超氧化物歧化酶在制备抗氧化制剂中的应用，所述抗氧化制剂为用于清除自由基、并抑制促炎细胞因子IL
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6、IL
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8 和TNF
‑
α释放的制剂。
[0015]进一步地，所述自由基包括DPPH自由基（1，1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼）、ABTS自由基（2，2'
‑
联氮
‑
双
‑3‑
乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸）、氧自由基和羟自由基。
[0016]进一步地，所述抗氧化制剂为用于预防或治疗与IL
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6、IL
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8 和TNF
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α相关的疾病或病症的制剂，所述疾病或病症包括癌症、与高凝性相关的疾病或病状、与升高的血清CRP相关的疾病或病状、与低白蛋白血症相关的疾病或病状、炎症性病症、病毒性病症、消耗综合征、自身免疫病症或其任意组合。
[0017]更进一步地，所述抗氧化制剂为用于预防或治疗慢性阻塞性肺病的制剂。
[0018]慢性阻塞性肺病（COPD）是以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，是闭塞性细支气管炎和肺实质破坏共同作用的结果，COPD到2030年将成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的全世界第三大死因，COPD患病率在40岁以上人群中高达8.2%，COPD不仅仅患病率高，致残、致死率也很高；rhSOD能专一地清除体内有害的自由基，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害，从而降低基体的氧化应激反应，并抑制促炎细胞因子IL
‑
6、IL
‑
8 和TNF
‑
α释放，从而降低COPD的发病率，并达到治疗和改善COPD的目的。
[0019]和/或，所述抗氧化制剂为用于预防或治疗人白血病细胞U937引起的白血病的制剂。
[0020]rhSOD能通过清除自由基和抑制炎症因子释放，来加强抗氧化系统作用，从而抑制内源性肿瘤启动子，来间接对人白血病细胞U937进行增值抑制和诱导凋亡，而不损害正常组织细胞，以达到预防和治疗白血病的目的。
[0021]和/或，所述抗氧化制剂为用于治疗烫烧伤和/或过敏引起的皮肤炎症的制剂。
[0022]rhSOD能通过专一地清除体内有害的自由基，避免肥大细胞和嗜碱粒细胞的氧化破坏，以解除自由基氧化体内的某些组成成分而造成的机体损害，如烫烧伤和/或过敏引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人超氧化物歧化酶，其特征在于：所述重组人超氧化物歧化酶的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。2.根据权利要求1所述的一种重组人超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，S1人工全基因合成所述重组人超氧化物歧化酶的核苷酸序列SEQ ID NO:2，并将其插入到pPICZαA载体的EcoRI和XbaI限制性酶切位点之间，得到重组载体pPICZαA
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rhSOD；S2将所述S1得到的重组载体线性化后导入毕赤酵母中，筛选高抗性转化子；S3培养所述S2得到的转化子，并诱导表达rhSOD，表达完成后经后处理，得到所述重组人超氧化物歧化酶。3.根据权利要求1所述的一种重组人超氧化物歧化酶在制备抗氧化制剂中的应用，其特征在于：所述抗氧化制剂为用于清除自由基、并抑制促炎细胞因子IL
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6、IL
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8 和TNF
‑
α释放的制剂。4.根据权利要求3所述的一种重组人超氧化物歧化酶的应用，其特征在于：所述自由基包括DPPH自由基、ABTS自由基、氧自由基和羟自由基。5.根据权利要求4所述的一种重组人超氧化物歧化酶的应用，其特征在于：所述抗氧化制剂为用于预防或治疗与IL
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6、IL
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8 和TNF
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α相关的疾病或病症的制剂，所述疾病或病症包括癌症、与高凝性相关的疾病或病状、与升高的血清CRP相关的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐登基，邵国梁，蒋路，
申请(专利权)人：杭州浦泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：