一种与麦角固醇合成相关的erg3基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域。本发明专利技术提供了一种与麦角固醇合成相关的erg3基因及其应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术利用NCBI库查找与炭黑曲霉相似度高的真菌erg3基因，通过序列比对结果及实验验证，最终确定了SEQ ID NO.1所示的基因为炭黑曲霉麦角固醇合成的基因。同时利用pCAMBIA1300载体与炭黑曲霉的erg3基因序列构建出可在乙酰丁香酮(AS)诱导下介导炭黑曲霉转化的农杆菌菌株，使erg3基因在炭黑曲霉菌株中得到敲除，获得的Δerg3敲除菌株可以降低炭黑曲霉的产孢数量和OTA的含量。erg3基因可以作为降低OTA含量的潜在靶点，极具应用潜力。极具应用潜力。极具应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种与麦角固醇合成相关的erg3基因及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种与麦角固醇合成相关的erg3基因及其应用。

技术介绍

[0002]赫曲霉毒素(Ochratoxins)是曲霉菌和青霉菌产生的一类代谢产物，包括赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)和赭曲霉毒素C(OTC)，其中以赭曲霉毒素A(OTA)的含量最高、毒性最强。OTA是一种无色结晶化合物，可溶于极性有机溶剂和稀碳酸氢钠溶液，被公认为是目前致癌力最强的天然物质之一，并且分布范围很广。它对动物和人体具有肾脏毒性，肝脏毒性，另外还有致畸、致突变和致癌作用，并有免疫抑制作用。炭黑曲霉是一株高产OTA的菌株，广泛污染于食品和环境中，抑制菌体产生OTA对提高食品安全和人体健康具有重要意义。
[0003]麦角固醇是微生物细胞膜的重要组成部分，对确保细胞活力、膜的流动性、膜结合酶的活性、膜的完整性以及细胞物质运输等起着重要作用。已有研究发现大多数常用的抗真菌药物都是针对麦角固醇生物合成中必需的关键酶设计的抑制剂，其通过竞争性地与关键酶结合，抑制麦角甾醇合成，使真菌的细胞膜受到破坏，从而抑制真菌的生长繁殖。
[0004]erg3基因主要编码麦角固醇合成过程中后期的关键酶(甾醇
△
5,6
‑
去饱和酶)，此酶可以使14
‑
甲基甾醇中间产物转化成细胞毒性的甾醇(14
‑
甲基
‑
3,6
‑
二醇)，即当erg3基因被敲除后，因为不能合成后期关键酶，而会使中间产物积累或者转化为成其他物质，从而细胞不能合成麦角固醇或者合成量不足。因此，我们选择炭黑曲霉中erg3相似基因进行敲除，根据麦角固醇含量来确定炭黑曲霉中的erg3基因以及该基因的敲除对菌体产孢和OTA产量的影响。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种与麦角固醇合成相关的erg3基因及其应用，降低赭曲霉毒素A产量和孢子产量。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种与麦角固醇合成相关的erg3基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]作为优选，所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了所述的erg3基因在降低炭黑曲霉菌体产孢中的应用。
[0010]本专利技术还提供了所述的erg3基因在降低赭曲霉毒素A含量中的应用。
[0011]本专利技术提供了一种与麦角固醇合成相关的erg3基因及其应用，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术利用NCBI库查找与炭黑曲霉相似度高的真菌erg3基因，通过序列比对结果及实验验证，最终确定了SEQ ID NO.1所示的基因为炭黑曲霉麦角固醇合成的基因。同时，利用pCAMBIA1300载体与炭黑曲霉的erg3基因序列构建出可在乙酰丁香酮
(AS)诱导下介导炭黑曲霉转化的农杆菌菌株，使erg3基因在炭黑曲霉菌株中得到敲除，获得的Δerg3敲除菌株可以降低炭黑曲霉的产孢数量和OTA的含量。erg3基因可以作为降低OTA含量的潜在靶点，极具应用潜力。
附图说明
[0012]图1为敲除erg3基因后炭黑曲霉与野生型炭黑曲霉的麦角固醇含量；
[0013]图2为敲除erg3基因后炭黑曲霉与野生型炭黑曲霉的孢子数量的测定；
[0014]图3为敲除erg3基因后炭黑曲霉与野生型炭黑曲霉OTA含量。
具体实施方式
[0015]本专利技术提供了一种与麦角固醇合成相关的erg3基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0016]在本专利技术中，所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]本专利技术还提供了所述的erg3基因在降低炭黑曲霉菌体产孢中的应用。
[0018]本专利技术还提供了所述的erg3基因在降低赭曲霉毒素A含量中的应用。
[0019]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0020]实施例1构建大肠杆菌重组菌株
[0021]1.通过比对真菌中的与麦角固醇合成相关的erg3基因获得炭黑曲霉中的erg3相似基因的编码序列，比对炭黑曲霉基因组，获得相似基因的上下游1000bp的同源臂，同时提取炭黑曲霉基因组备用。
[0022]2.炭黑曲霉基因组的提取
[0023](1)从平板上刮取幼嫩的菌丝置于无菌2mL离心管中。
[0024](2)离心收集菌体，12000rpm，4℃，10min。
[0025](3)加入等量石英砂，加入Breakingbuffer200μL，通风橱中加入抽提液200μL，细胞振荡仪，振幅50，10min。
[0026](4)加入200μL水(禁止上下摇晃)。
[0027](5)12000rpm，4℃，离心10min。
[0028](6)取200μL上清于新的离心管中。
[0029](7)加入1mL无水乙醇。
[0030](8)12000rpm，4℃，离心10min。
[0031](9)倒掉上清液，旋蒸仪60℃，6
‑
10min。
[0032](10)加入已经预热60℃的ddH2O 50μL。
[0033]3.利用设计的引物UP
‑
F、UP
‑
R；Down
‑
F、Down
‑
R，通过Gibson连接方法(Gibson,D.G.et al.，2009)，将erg3基因的上下1000bp同源臂基因序列构建于pCAMBIA 1300表达载体(实验室保存)，获得重组载体pCAMBIA 1300
‑
erg3。
[0034]UP
‑
F：(SEQ ID NO.3)
[0035]CAGCTGCATTAATGAATCGTCCAATATCCTGACGGGAC；
[0036]UP
‑
R：(SEQ ID NO.4)
[0037]CGCGCGTTGGCCGATTGGATCAGGAGAGTTGCGGATG；
[0038]Down
‑
F：(SEQ ID NO.5)
[0039]AACTCTCCTGATCCAATCGGCCAACGCGCGGGGAG；
[0040]Down
‑
R：(SEQ ID NO.6)
[0041]TTGATACTAAGAGTAGCGGACGTTTTTTAATGTACTGAATTAACGC CGAATTAATTCGGGGGA；
[0042]4.Gibson连接体系配制
[0043](1)准备5
×
ISO buffer，5
×
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种与麦角固醇合成相关的erg3基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的erg3基因，其特征在于，所述基因的氨基酸序列如...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋春美，杨赛雪，宋佩，吉玉兰，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：