一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法，涉及生物化学领域，纯化方法，包括如下步骤：步骤一，初提：将菌体破碎，冰浴下将菌体与裂解液搅拌混匀，经过离心得到初提离心上清液；步骤二，配制中试层析工作液：步骤三，提纯：1)CM柱层析；2)肝素亲和层析；3)SP强阳离子交换层析；本发明专利技术通过在肝素亲和层析后选择SP强阳离子交换层析进行了最后的多聚体分离，确保工艺所获得的产品更加稳定可控。加稳定可控。加稳定可控。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物化学领域，特别是一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法。

技术介绍

[0002]重组人碱性成纤维细胞生长因子，来源于基因工程重组的大肠杆菌；在促进创面愈合，烧伤创面(包括浅Ⅱ度、深Ⅱ度、肉芽创面)、慢性创面(包括慢性肉芽创面、溃疡和褥疮等) 和新鲜创面(包括外伤、手术伤等)上具有广泛的应用。
[0003]本司前期纯化工艺获得的原液虽然经检测各项质量标准均可符合质量要求，但对于多聚体或其他相关杂质，工艺中没有设计出可分离的有效步骤，对于后续放大造成潜在不可控风险。hbFGF蛋白易被氧化而形成聚合，常规层析过程如无法将多聚体进行有效分离，反而可能在层析处理过程中更多的单体蛋白转变成多聚体。
[0004]市场需要围绕多聚体或其他相关杂质实现有效分离为目的进行一系列的工艺优化。需要经过实验研究和工艺放大，建立了一种高纯度高产量的重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法；本专利技术解决这样的问题。

技术实现思路

[0005]为解决现有技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，初提：将菌体破碎，冰浴下将菌体与裂解液搅拌混匀，经过离心得到初提离心上清液；步骤二，配制中试层析工作液：中试层析工作液包括：预处理盐水，A液，B液，CM平衡液，CM洗脱液，CM再生液，肝素平衡液，肝素洗脱液，SP平衡液，SP洗脱液，SP再生液，碱水；步骤三，提纯：1)CM柱层析；2)肝素亲和层析；3)SP强阳离子交换层析。2.根据权利要求1所述的一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法，其特征在于，所述裂解液的配方为：20mmol/L氨丁三醇、10mmol/L依地酸二钠、50mmol/L氯化钠、10％甘油。3.根据权利要求1所述的一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法，其特征在于，所述预处理盐水的配方为：20mmol/L PB、2.0mol/L氯化钠；所述A液的配方为：20mmol/L PB、10％甘油；所述B液的配方为：20mmol/L PB、2.0mol/L氯化钠、10％甘油；所述CM平衡液的配方为：7.60L A液、0.40L B液；所述CM洗脱液的配方为：2.46L A液、0.54L B液；所述CM再生液的配方为：2.0L B液；所述肝素平衡液的配方为：1.75L A液、0.75L B液；所述肝素洗脱液的配方为：1.5L B液；所述SP平衡液的配方为：1.31L A液、0.19L B液；所述SP洗脱液的配方为：1.13L A液、0.37L B液；所述SP再生液的配方为：0.75L B液；所述碱水为0.5mol/L氢氧化钠。4.根据权利要求1所述的一种高纯度重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化方法，其特征在于，所述CM柱层析包括如下步骤：步骤a，CM柱预处理：泵入0.5mol/L NaOH溶液1.2～1.5个柱体积，暂停系统泵并封柱静置30～60min，随后，泵入注射用水直至流出液pH呈中性，暂停系统泵；步骤b，CM柱平衡：将CM层析柱置于2～8℃，并将系统泵的流速和压力阈值设为50ml/min和0.15MPa，以280nm作为检测紫外波长A
280
进行在线监测，泵入预冷的CM平衡液1.5～2.5个柱体积，直至基线平稳，且流出液pH稳定于7.45～7.55之间，电导值稳定于8.0～12.0ms/cm之间时，对紫外检测器进行校零后，暂停系统泵；
步骤c，CM柱上样：将预冷的初提离心上清液以50ml/min的流速泵入CM柱中，冰浴下收集A
280
值高于0.15AU的流出液，待离心上清液全部泵入暂停系统泵；步骤d，CM柱再平衡：以50ml/min的流速，泵入预冷的CM平衡液3.5～5.0个柱体积，待流出液的A
280
值低于0.12AU，且pH稳定于7.45
‑
7.55之间，电导值稳定于8.0～12.0ms/cm之间时，暂停系统泵；步骤e，CM柱洗脱：以50ml/min的流速，泵入预冷的CM洗脱液1.5～3.0个柱体积，当洗脱体积大于0.8个柱体积后，紫外吸收值将出现较大升高，且点切线延伸与紫外吸收值升高趋势线基本重合，将此点设为收样起始点A
始
，并开始收集CM柱洗脱样品；当A
280
值降至A
始
±
0.03AU时结束收样，将CM柱洗脱样品暂存于2～8℃，并于2h内进行下一步柱纯化层析，当A
280
值降至0.05AU以下时，暂停系统泵；步骤f，CM柱再生：以50ml/min的流速，泵入预冷的CM再生液1.5～2.0个柱体积；步骤g，CM柱预处理：泵入NaOH溶液1.2～1.5个柱体积，暂停系统泵并封柱静置30～60min，随后，泵入注射用水直至流出液pH呈中性，暂停系统泵；步骤h，CM柱平衡：将CM层析柱置于2～8℃，并将系统泵的流速和压力阈值设为50ml/min和0.15MPa，以280nm作为检测A
280
紫外波长进行在线监测，泵入预冷的CM平衡液1.5～2.5个柱体积，直至基线平稳，且流出液pH稳定于7.45～7.55之间，电导值稳定于8.0～12...

【专利技术属性】
技术研发人员：惠琦，王晓杰，李校堃，李乐，顾佳伟，余丙洁，黄臻，林敬畏，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：