一种可透过细胞膜的溶菌酶制造技术

一种可透过细胞膜的溶菌酶，其内容是：将市场供应的溶菌酶(lysozyme)与人工合成或基因表达的C端尾部含有半胱氨酸的TAT穿膜肽，通过温和双功能偶联反应试剂

【技术实现步骤摘要】
一种可透过细胞膜的溶菌酶


[0001]本专利技术涉及一种可透过细胞膜的溶菌酶(lysozyme)，主要服务于人及动物的传染病学、医学微生物学及动物微生物学等领域。
[0002]专利技术背景
[0003]溶菌酶是一种可以裂解细菌等微生物菌体的蛋白酶，通过溶解细胞壁，破坏保护细胞的保护层。从而实现杀灭病菌，控制病害的目的。
[0004]自然界中许多病原微生物尤其胞内菌，它们进入人及动物机体后，隐藏于人的细胞内，使体液免疫中的抗体无法接触到病原菌，体液免疫无法杀灭病原菌，同时细胞免疫中的致敏淋巴细胞也无法接触到病原菌，化学药物也可能细胞膜的保护而无法杀死病原菌，而病原菌本身也会抑制宿主细胞内细胞器的攻击，导致宿主细胞无法将病原菌杀灭，从而使病原菌可以暂时或长期呆在宿主细胞内，两者保持相对平衡。宿主抵抗力一旦下降，病原菌就会大量扩增，引起人身发病。
[0005]设计了本专利技术，希望能对胞内菌的杀灭有一定的帮助。

技术实现思路

[0006]由于溶菌酶的活性中心关键氨基酸是天门冬氨酸和谷氨酸，它们是侧链带有羧基.如果通过羧基与氨基之间双功能偶联试剂
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水溶性碳化二亚胺偶联剂(EDC)偶联时就有可能使用了酶活性中心的关键氨基酸，从而会影响溶菌酶的活性。
[0007]研究溶菌酶结构与序列，可以专利技术其内部有4对双硫链，没有自由的巯基存在。如果通过巯基
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巯基之间偶联的话，需要特定化学试剂打开溶菌酶中的双硫键，否则无法找到偶联的巯基，同时打开双硫链也有可能会影响酶的活性。
[0008]同时也注意到溶菌酶中大约有5个赖氨酸，赖氨酸侧链存在自由的氨基，N端有一个自由氨基，这样溶菌酶上共6个自由氨基。并且此处的赖氨酸并不是溶菌酶的活性中心，因而可以作为偶联位点。考虑到穿膜肽中也含有赖氨酸，偶联时尽量不使用穿膜肽中的赖氨酸，避免影响其穿膜功能.用氨基
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氨基之间的偶联试剂进行偶联时就有可能影响穿膜肽的穿膜功能。
[0009]因而考虑在人工合成或基因表达穿膜肽时，在穿膜肽的尾部增加一个半胱氨酸，即增加一个巯基，将TAT肽新增的尾端巯基与溶菌酶中氨基通过偶联试剂进行偶联。
[0010]如果将偶联好的溶菌酶与脂质体技术结合，减少溶菌酶在血液循环时被降解，尤其是穿膜肽被降解。
[0011]一种可透过细胞膜的溶菌酶，其内容是：将市场供应的溶菌酶(lysozyme)与人工合成或基因表达的C端尾部含有半胱氨酸的TAT穿膜肽，通过温和双功能偶联反应试剂
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将巯基
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氨基之间偶联试剂进行偶联，实现每一个溶菌酶分子带共价偶联1
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6个穿膜肽，偶联后得到复合物依然保持溶菌酶的活性，同时该复合物中带有1
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6个穿膜肽，确保拥有穿过细胞膜的功能。
[0012]具体步骤为：
[0013]将10umol溶菌酶量溶解于pH8.5的水溶液中，加入10
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50umol的氨基与巯基双功能偶联剂，室温下反应10
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30min，调pH至7.0，然后将带巯基TAT肽pH 6.5盐理盐水加入上述反应中，混匀室温下进行偶联30min，生成TAT肽
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溶菌酶共价偶联复合物，并且TAT穿膜肽与溶菌酶的摩尔数比为：1
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5∶1。TAT穿膜肽用量多一些是减少，溶菌酶复合物在输液时被血液中的蛋白酶完全降解掉TAT穿膜肽，使溶菌酶复合物失去穿膜功能.
[0014]实现每个溶菌酶上共价结合3
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6个穿膜肽分子。偶联后超滤膜去除可能存在非必要化学成份，0.22孔径细菌滤器过滤除去大的颗粒，然后再与脂质体混合，实现脂质体包裹该溶菌酶。反应剂量增大时，上述试剂比例可同比放大，进行偶联反应。
[0015]可行性分析：
[0016]溶菌酶市场上有出售，TAT肽序列较短可以人工合成，也可以基因表达来获得。双功能剂3
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马来酰亚胺丙酸N
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羟基琥珀酰亚胺酯(cas号55750
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62
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4)、11
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马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯(cas号87981
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04
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2)等市场有出售。反应条件是温和反应，因而不会影响溶菌酶的活性，也不会影响穿膜肽的活性.穿膜肽与溶菌酶的偶联是免疫学实验技术中短肽半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联中常用技术。
[0017]市场上的溶菌酶对人及动物来说可能是异源蛋白，但是用于治疗时用时较短，大约一周左右就停止使用，人及动物机体在一周内来不及产生抗体及致敏淋巴细胞。其原理类同蛇毒抗血清治疗毒蛇咬伤，蛇毒抗血清对于人来说也是异源蛋白。治疗完成后就停止使用，因而后续产生免疫清除反应时，治疗目标已经完成。
[0018]由于该蛋白中存在溶菌酶是生物活性材料，可参照文献穿膜肽
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超氧化物歧化酶(TAT
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SOD)脂质体的制备方法等资料，控温在40℃以下相对温和的条件下制备脂质体，确保酶的活性保持，将溶菌酶进入脂质体内，将更加有助于TAT穿膜肽的保护，提高溶菌酶复合物穿膜效果。
[0019]使用前要做过敏皮试，对过敏患者，需更换其他种类的溶菌酶再进行过敏皮试，直至找到不过敏的溶菌酶才能使用，否则禁止使用。
[0020]本专利技术的创新点在于：
[0021]1、利用溶菌酶非活性中心的氨基酸侧链基团进行偶联，保持溶菌酶本身杀灭病原菌的特点不变，在温和反应条件下将穿膜肽共价偶联到溶菌酶上，使溶菌酶复合物具备了穿膜功能.
[0022]2、带有穿膜肽的溶菌酶复合物通过注射或输液的方法进入体液循环，送达每个细胞中.
[0023]3、在每个溶菌酶上偶联了3
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5个穿膜肽，防止穿膜肽被降解，因为在经过血液循环时可遇上体内蛋白降解酶，一旦没有了穿膜肽，溶菌酶就失去穿膜能力。
[0024]4、如果能结合脂质体的应用就是减少本专利技术中的可穿过细胞膜的溶菌酶与血液中的降解酶接触，进而将会减少偶联中的穿膜肽的用量，进一步提升溶菌酶效果。
具体实施方式
[0025]实施例1
[0026]将10umol溶菌酶量溶解于pH 8.5的水溶液中，加入30umol的氨基与巯基双功能偶联剂3
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马来酰亚胺丙酸N
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羟基琥珀酰亚胺酯，室温下反应10
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30min，调pH至7.0，然后将
30umol带巯基TAT肽pH6.5盐理盐水加入上述反应中，混匀室温下进行偶联30min，生成TAT肽
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溶菌酶共价偶联复合物，并且TAT穿膜肽与溶菌酶的摩尔数比为：1
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5∶1。TAT穿膜肽用量多一些是减少，溶菌酶复合物在输液时被血液中的蛋白酶完全降解掉TAT穿膜肽，使溶菌酶复合物失去穿膜功能。反应剂量增大时，上述试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可透过细胞膜的溶菌酶，其内容是：将市场供应的溶菌酶(lysozyme)与人工合成或基因表达的C端尾部含有半胱氨酸的TAT穿膜肽，通过温和双功能偶联反应试剂一将巯基
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氨基之间偶联试剂进行偶联，偶联时先将溶菌酶与偶联试剂进行氨基偶联反应，pH8.5，然后改变pH在6.5
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7.5之间进行TAT穿膜肽上的巯基偶联，实现每一个溶菌酶分子带共价偶联1
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5个穿膜肽。偶联后得到复合物保持溶菌酶的活性，同时该复合物中带有1
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5个穿膜肽，确保拥有穿过细胞膜的功能。偶联时要严格控制偶联时pH值以及各试剂比例以及试剂的次序。2.依据权利要求1所述，具体步骤：将10umol溶菌酶量溶解于pH 8.5的水溶液中，加入30umol的氨基与巯基双功能偶联剂3
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马来...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈正贤，
申请(专利权)人：陈正贤，
类型：发明
国别省市：