本发明专利技术公开了一种肝外胆管癌(eCCA)基因工程动物模型的构建方法，所述动物模型是特异性敲除肝外胆管上皮细胞上Pten基因所诱导的动物模型。具体地，本发明专利技术还提供了用于构建eCCA动物模型的构建物组合、Pten基因被重组敲除的哺乳动物的胆管上皮细胞系及上述各方面在eCCA领域的应用。本发明专利技术的eCCA动物模型中可以观察到一系列病理改变，包括胆管炎样改变、低度不典型增生、高度不典型增生，最后发展为侵袭性eCCA。该模型再现了人类eCCA发生发展的许多方面，包括细胞转化、癌前病变、侵袭性肿瘤和转移性疾病。本发明专利技术的模型对于研究这种高致死性疾病的发生发展机制具有重要意义，有助于制定有效的新型预防措施及治疗方案，以及应用于相关潜在抗肿瘤药物筛选及疗效评估领域。于相关潜在抗肿瘤药物筛选及疗效评估领域。
【技术实现步骤摘要】
肝外胆管癌基因工程动物模型及其构建和应用
[0001]本专利技术涉及分子生物学与生物医药
，具体地说，是一种Pten基因条件性敲除(Pten
‑
CKO)的eCCA基因工程动物模型及其构建方法和在eCCA研究中的应用。
技术介绍
[0002]胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是一类具有高异质性、高致死性的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命和健康，给患者造成身体、心理及经济上的巨大负担。CCA根据解剖部位不同分为肝内癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)、肝周癌(Perihilar cholangiocarcinoma,pCCA)和远端癌(Distal cholangiocarcinoma,dCCA)。pCCA和dCCA被统称为肝外胆管癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma,eCCA)，占所有CCA病例的90％以上。不同亚型CCA不仅解剖位置不同，而且生物学行为和临床特征也有所不同。流行病学报告显示，近年来CCA的发病率在全球范围内不断增加，然而其5年生存率仍不足10％，这种不良的预后主要与缺乏适当的早期诊断工具和有效的治疗方法有关。
[0003]近年来高通量技术的应用，如二代测序(Next
‑
generation sequencing,NGS)和其他“组学”方法，在一定程度上拓宽了人们对CCA发病机制的认知，提示CCA与基因变异有关，且与肿瘤微环境存在复杂的相互作用。已经在CCA中确定了广泛的基因改变，包括KRAS基因的致癌突变，或肿瘤抑制基因的失活突变，如TP53、SMAD4和Pten，其中一些有望或正在成为治疗的靶点。
[0004]除人类研究外，基因工程小鼠(Genetically engineered mouse,GEM)模型对于了解该疾病的发生发展尤为重要。目前已经产生了一系列GEM模型，其中包括癌基因(如KRAS)和抑癌基因(如TP53、SMAD4和Pten)的改变，但这些模型多由Alb
‑
Cre或Alfp
‑
Cre系统所驱动，因此诱导的CCA模型多为iCCA或iCCA与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的混合型肿瘤。
[0005]目前可追溯的关于eCCA的条件性GEM模型的研究主要有三篇：1)Falcomata等利用Pdx1启动子介导的Cre重组酶组成性激活肝外胆管上皮细胞上PI3K
caH1047R
，最终诱导了eCCA的发生发展。Falcomata等的研究结果模拟了人类胆道上皮内瘤变(Biliary intraepithelial neoplasia,BilIN)前体病变的全过程，但成瘤潜伏期较长(9月)；2)Nakagawa等构建的eCCA模型制作过程较为复杂，涉及对KRAS
G12D
、TGFβR2、CDH1等多个基因的联合编辑，致癌时间虽快，但很快因肺部转移导致肺功能衰竭，小鼠多在4周内死亡，不适合进行长时间的研究和观察；3)Lin等基于Alb
‑
Cre重组酶，通过条件性激活KRAS、失活Pten最终构建了eCCA GEM模型，该模型具有成瘤潜伏期短(12周)，同时有肝胆胰系统肿瘤发生的优点，是研究肝胆胰导管系统疾病的良好工具。然而其缺点在于诱导的模型为多系统肿瘤，非专一性的eCCA模型，且iCCA与eCCA均呈现低级别腺瘤变，无远处转移发生，不能很好地模拟人类eCCA的发生发展。
[0006]可见，目前仍缺乏合适的能够很好地表征临床相关微环境背景下eCCA发生、发展的条件性GEM模型。本领域迫切需要开发一种可以作为研究eCCA发生发展机理以及潜在抗
肿瘤药物筛选、疗效评估的有力工具的动物模型。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的就是提供一种Pten基因条件性敲除的eCCA基因工程动物模型及其构建方法和在eCCA研究中的应用。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种肝外胆管癌eCCA动物模型的制备方法，所述方法包括步骤：
[0009](a)提供第一动物，所述第一动物为携带loxp序列的Pten
L/L
动物，和提供第二动物，所述第二动物为携带Pdx1启动子控制的Cre重组酶的Pdx1
‑
Cre动物；
[0010](b)将第一动物和第二动物进行杂交，获得杂合Pten缺失的F1代Pten
L/+
/Pdx1
‑
Cre动物；
[0011](c)将F1代动物与第一动物继续杂交，获得纯合Pten缺失的Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre动物；
[0012]任选地，所述方法还包括选自下组的步骤：
[0013](d)将Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre基因型的动物自交3代以上，从而得到基因型稳定的Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre基因型的动物；
[0014]获得的Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre动物即为敲除肝外胆管Pten基因的eCCA动物模型。
[0015]在另一优选例中，所述eCCA动物模型中全胰腺组织及肝外胆管，而非肝内胆管组织的Pten基因表达降低。
[0016]在另一优选例中，所述敲除涉及的动物基因组是全胰腺组织及肝外胆管的基因组，而非肝内胆管组织的基因组。
[0017]在另一优选例中，所述Pten基因为Pten基因的第5号外显子序列。
[0018]在另一优选例中，所述eCCA动物模型具有选自下组的基因型：Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre、Pten
L/L
/R26
‑
LacZ
L/L
/Pdx1
‑
Cre。
[0019]在另一优选例中，所述eCCA动物模型为啮齿动物。
[0020]在另一优选例中，所述eCCA动物模型为小鼠或大鼠。
[0021]在另一优选例中，所述Pten基因的表达降低指的是，在所述eCCA动物模型中Pten基因的表达量A1与正常小鼠中的Pten基因的表达量A0之比A1/A0≤2/3，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3，或为0。
[0022]在另一优选例中，所述Pten基因的表达降低指的是，在所述eCCA动物模型中Pten基因的表达量A1与正常小鼠中的Pten基因的表达量A0之比A1/A0≤2/3。
[0023]在另一优选例中，所述Pten基因的表达降低指的是，在所述eCCA动物模型中Pten基因的表达量A1与正常小鼠中的Pten基因的表达量A0之比A1/A0≤1/2。
[0024]在另一优选例中，所述Pten基因的表达降低指的是，在所述eCCA动物模型中Pten基本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种肝外胆管癌eCCA动物模型的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(a)提供第一动物，所述第一动物为携带loxp序列的Pten
L/L
动物，和提供第二动物，所述第二动物为携带Pdx1启动子控制的Cre重组酶的Pdx1
‑
Cre动物；(b)将第一动物和第二动物进行杂交，获得杂合Pten缺失的F1代Pten
L/+
/Pdx1
‑
Cre动物；(c)将F1代动物与第一动物继续杂交，获得纯合Pten缺失的Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre动物；任选地，所述方法还包括选自下组的步骤：(d)将Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre基因型的动物自交3代以上，从而得到基因型稳定的Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre基因型的动物；获得的Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre动物即为敲除肝外胆管Pten基因的eCCA动物模型。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eCCA动物模型中全胰腺组织及肝外胆管，而非肝内胆管组织的Pten基因表达降低。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Pten基因为Pten基因的第5号外显子序列。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述eCCA动物模型为啮齿动物；优选地，所述eCCA动物模型为小鼠或大鼠。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Pten基因的表达降低指的是，在所述eCCA动物模型中Pten基因的表达量A1与正常小鼠中的Pten基因的表达量A0之比A1/A0≤2/3，较佳地≤1/2，更佳地≤1/3，或为0。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述eCCA动物模型进行选自下组的多项检测：(m1)通过基因鉴定，对Pten
L/L
/Pdx1
‑
Cre或Pten
L/+
/Pdx1
【专利技术属性】
技术研发人员：杨燕，纪保安，朱建，李曼，邵玉，周雪丽，程倩倩，王威，季文斌，
申请(专利权)人：蚌埠医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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