使用成骨细胞与生物基质的混合物的成骨用组成物及其制造方法技术

本发明专利技术提供了一种使用成骨细胞与生物基质的混合物的成骨用组成物及其制造方法，此方法包括：从骨组织中分离成骨细胞，在ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　　ｓ　　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｅａｇｌｅ’　　ｓ　　Ｍｅｄｉｕｍ）或者α－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　　Ｍｅｄｉｕｍ，Ａｌｐｈａ　　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）中培养／增生分离的成骨细胞，制备成骨细胞悬浮液；及将获得的成骨细胞悬浮液与生物基质混合制备成骨细胞治疗剂。遵循本发明专利技术，实现了一种成骨方法，通过向成骨部位注射成骨细胞和生物基质的混合物，无临床排异反应，通过注射一定量的组成物获得高效和快速的成骨，以致减轻由于注射的成骨细胞从骨结合区域逃逸而造成的非必要区域骨组织形成及成骨细胞通过血流增生的问题，这个问题是由于注射成骨细胞悬浮液而造成的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种使用成骨细胞和生物基质混合物的成骨用组成物及其制 备方法，尤其涉及一种用于骨缺陷或者所需区域成骨移植的使用成骨细胞和 生物基质混合物的成骨用组成物及其制备方法。
技术介绍
根据世界健康组织(World Health Organization, WHO)的报道，超过半 数的65岁以上老人遭受慢性骨病的痛苦，并且与骨质疏松有关的骨折发生数 量是过去十年的2倍。这些数据与40%的50岁及50岁以上的女性相似。在美国，每年大概有560万人经历骨折，其中的310万人进行外科手术。 根据国际医学数据(Medical Data International, MDI)的统计报道，1995年 共实施了 426,000例骨移植手术。全球一年用于骨移植的费用大约为8亿美元。 仅仅1995年一年，骨移植包括58%的自体移植，34%的异体移植及8%的合 成材料移植。通常，简单的(封闭的)骨折用石膏固定几个星期就可以完全愈合，但 是严重的骨折或者骨缺陷需要骨移植。然而，自体移植的缺点是在骨接受区域会引起强烈的疼痛，在骨移植手 术后需要很长一段时间恢复，并且保护用于骨移植的供体部位是十分困难的。同时，异体移植也要经历致命的缺点，例如灭菌过程造成的骨强度变弱， 出现移植排异反应，被传染性疾病传染，例如乙型肝炎和艾滋病。另外一种骨移植可用方法，在具有生物活性的金属或者非生物活性的陶 制材料上涂一层在整形外科手术中广泛应用的支撑材料，但是由于一些问题 在骨移植中应用金属是十分困难的，例如金属的腐蚀性问题，覆盖金属陶瓷 表面，骨及被移植部位表面剧烈形成纤维性组织。至于骨形成因素，尽管从1952年Urist和Mclean公布成骨蛋白对骨形成 的影响以来有大量关于不同因素的研究，但是其生产过程是非常复杂和昂贵的，并且低效，这导致了低产以及最终有限的临床应用。同时，骨髓注射是基于Huggins (1931 ), Friedenstein ( 1973 ),和Ashton (1980)声明的技术，其中来自骨髓的骨原细胞促进并推动骨形成。骨髓注 射在治疗骨折时通常单独使用，但也在骨移植中使用。与其它骨移植技术不 同，这种骨髓注射供体不需切开皮肤，十分有利于保护供体，没有并发症或 其它不利影响。其后，尽管大量临床应用病例获得好结果被报道，骨髓注射的缺点是不 具有健全的理论基础，获得的相当一部分结果间不具有一致性，从一个位置 收集的骨髓数量是有限的，骨髓中的骨原细胞的数量是相当有限的。这样， 一种新的骨形成和移植方法，通过培养、扩增骨原细胞获得足够 数量的成骨细胞，将培养的细胞与生物基质混合，将获得的混合物注射到成 骨区域，这是一种高效的方法，有重大优势和有益效果，与传统自体移植或 异体移植和骨髓注射相比，这种骨再生治疗方法在组织工程学领域获得了大 量关注。因此，基于上述由移植或者传统骨移植技术带来的问题，本专利技术的一个方法，通过向骨结合的部位注射成骨细胞和纤维蛋白的混合物，无临床移植 排异，通过注射适于一定程度的组成物可以获得有效、快速的骨结合，以致 减轻由于注射的成骨细胞从骨结合区域逃逸而造成的非必要区域骨组织形成 及成骨细胞通过血流增生的问题，这个问题是由于注射成骨细胞悬浮液而造 成的。
技术实现思路
与本专利技术的一个方面一致，上述及其它目的通过提供一种制备用于骨结 合的组成物的方法来实现，包括从骨组织中分离成骨细胞及其前体细胞，在DMEM (Dulbecco，s Modified Eagle's Medium ) 或者 a隱MEM ( Minimum Essential Medium, Alpha Modification)中培养/增生分离的成骨细胞及其前提细胞，制备成骨细胞悬浮液；及将获得的成骨细胞悬浮液与生物基质混合制备成骨细胞治疗剂。 其中，治疗剂的制备步骤进一步包括将成骨细胞混合溶液与凝血剂混合，所述成骨细胞悬浮液混有生物基质。其中，混合步骤包括成骨细胞混合溶液与IO至100IU/mL的作为凝血剂的凝血酶混合；含有凝血酶的混合溶液与20至100mg/mL的作为凝血剂的血纤蛋白原混合。其中，生物基质^J交原蛋白、羟磷灰石或者二者的混合物。其中，胶原蛋白向成骨细胞悬浮液中的加量为67 A/g/mL至20 mg/mL，羟磷灰石向成骨细胞悬浮液中的加量为30 Aig/mL至3.4mg/mL。胶原蛋白与成骨细胞悬浮液混合前用中和溶液中和至中性pH值。在向骨细胞与生物基质的混合溶液中加入前，冻干凝血酶要先溶解于液体DMEM或者a-MEM中，磷酸盐离子(PO -) 作为骨矿物质成分加入，在培养基质中磷酸盐离子(po43-)的加量是凝血酶的两倍。然后，在向获得的成骨细胞混合溶液中加入前，冻干血纤蛋白要先溶解于液体DMEM或者 a-MEM中，钩离子(Ca2+)作为骨矿物质成分加入，在培养基质中钙离子 (Ca2+)的加量是血纤蛋白的两倍。与本专利技术的另一方面相一致，提供了一种用上述方法制备的用于骨形成 的组成物，该组成物使用成骨细胞和生物基质的混合物。与现有^^支术相比，本专利技术具有以下优点与一种用于骨结合的使用成骨细胞和生物基质混合物的组成物及其制备 方法相一致，如上所述，通过向骨结合部位注射成骨细胞和生物基质的混合 物，能够完成骨形成，无临床移植排异，通过注射适于一定程度的组成物可 以获得有效、快速的骨结合，以致减轻由于注射的成骨细胞从骨结合区域逃 逸而造成的非必要区域骨组织形成以及成骨细胞通过血流增生的问题，这个 问题是由于注射成骨细胞悬浮液而造成的。附图说明图l是骨形成速率曲线图；图2是用本专利技术所述的成骨细胞和生物基质的混合物制备成骨组成物的 工艺流程图；图3是向免疫缺陷鼠皮下注射由成骨细胞和生物基质组成的成骨细胞治 疗剂的照片；图4是移植由成骨细胞和生物基质组成的成骨细胞治疗剂4周后的免疫缺 陷鼠照片；图5是移植由成骨细胞和生物基质组成的成骨细胞治疗剂4周后的移植体 照片；图6是移植由成骨细胞和生物基质组成的成骨细胞治疗剂4周后的免疫缺 陷鼠放射自显影图；图7是移植由成骨细胞和生物基质组成的成骨细胞治疗剂8周后，能证确 认骨形成的苏木精-曙红染色组织切片图；图8是移植由成骨细胞和生物基质组成的成骨细胞治疗剂8周后，能证确 认骨形成的Masson三色法染色组织切片图。具体实施方式本专利技术一种使用成骨细胞和生物基质混合物制备用于骨形成的组成物的 方法将参考附图做进一步详细描述。为了克服传统治疗方法治疗骨相关错乱和疾病的不足，例如移植和骨移 植，通过培育成骨细胞，自体成骨细胞移植技术作为最后的治疗方法在受损 部位无副作用，与传统治疗方法的改进共同发展。然而，为了获得更快的骨结合，需要将成骨细胞与基质混合来治疗多种 病变，因此，仅仅注射由成骨细胞构成的液体成骨细胞悬浮液可能治疗多种 骨疾病，没有获得治疗的益处。可以这样说，由成骨细胞和生物基质混合物制成的成骨细胞治疗剂是一 种更先进的基于细胞治疗的注射液体成骨细胞悬浮液方法的方式。传统的液 体成骨细胞悬浮液注射方法，包括单独移植成骨细胞，仅仅可以治疗有限类 型的骨缺陷，并且要遭受一些由于注入的成骨细胞从骨形成位点逃逸，骨组织在非必要区域形成，及经过血流在其它位点增生的相关问题。相反地，本 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用成骨细胞和生物基质混合物制备成骨组成物的方法，其特征在于，包括：　　　　从骨组织中分离成骨细胞及其前体细胞，在ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｅａｇｌｅ’ｓ　　Ｍｅｄｉｕｍ）或者α－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　　Ｍｅｄｉｕｍ，Ａｌｐｈａ　　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）中培养／增生分离的成骨细胞及其前体细胞，制备成骨细胞悬浮液；　　　　及将获得的成骨细胞悬浮液与生物基质混合制备成骨细胞治疗剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：张在德，朴炫信，张晶皓，郑修真，李玺邦，高畅权，
申请(专利权)人：世源世龙股份有限公司，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]