一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，包括PCR反应液和内标，所述PCR反应液包括乙型肝炎病毒靶基因的引物探针HBV

【技术实现步骤摘要】
一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒（HBV）感染是慢性肝病的主要原因。据估计，全世界有近20亿人感染了乙肝病毒，超 过3.5亿人持续慢性感染。乙肝病毒携带者发展为乙肝长期后遗症的风险很高，包括肝硬变和肝细胞癌，在像意大利这样的乙肝病毒感染中等流行的国家，这些疾病占参考中心肝移植适应症的近25%。基于新的和更强大的核苷类似物的开发，抗病毒治疗的最新进展极大地改善了慢性乙肝的管理，包括预防因乙肝病毒相关疾病而接受肝移植的患者的移植物再感染。
[0003]传统临床上对于乙型肝炎病毒携带者的检测多选用血清血标标志物法，主要检测样本为患者血液，在临床血清学检测过程中会因操作失误导致检测人员感染的情况。且传统的血清检测是一种定性的检查方法，了解机体免疫状态及间接反应病毒的复制情况，但当病毒发生变异或处于窗口期时，该方法具有局限性，导致假阴性结果。而乙型肝炎病毒核酸(HBVDNA)检测可直接反映机体内HBV的复制情况，对乙型肝炎感染情况的诊断、药物疗效监测、预后判断都具有极其重要的意义。所以为了保证乙肝患者检测结果的准确性，本专利技术采用实时荧光定量PCR法对乙肝病毒DNA进行检测评价该方法在临床检查中的应用价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒及其使用方法。可以高效、灵敏地对血液样本中乙型肝炎病毒载量进行检测，能保证患者的及时诊治及治疗效果监测，适合于大规模临床开展。
[0005]本专利技术提供一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，包括PCR反应液和内标，所述PCR反应液包括乙型肝炎病毒靶基因的引物探针HBV
‑
F、HBV
‑
R和HBV
‑
P，所述PCR反应液还包括内标基因的引物探针IC
‑
F、IC
‑
R和IC
‑
P，所述HBV
‑
P和所述YGNB
‑
P为荧光探针，其中，HBV
‑
F：5' GACAAACAGTATTACAGCATAGTTTTAATG 3'；HBV
‑
R：5'AGTTAGTTTGAGGATACCTTTGAATTATC3'；HBV
‑
P：5'CTGCCCACTCCGAATCGTGCTGACCAGTTTGA3'；IC
‑
F：5'AGATTTGGACCTGCGAGCG3'；IC
‑
R：5'GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3'；IC
‑
P：5'TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG3'。
[0006]应用上述技术方案中的试剂盒，可以高效、灵敏地对血液样本中乙型肝炎病毒载量进行检测，检出范围广，检出下限低，能够保证患者病毒的检出，同时，引物探针HBV
‑
F和HBV
‑
R用于扩增乙型肝炎病毒C基因区基因，C基因区为乙型肝炎病毒核心抗原，特异性强，准确度高。因此，所述试剂盒能够为患者的疾病诊断提供依据并且在治疗过程中使用，能够
为患者的治疗效果提供监测依据，适合于大规模的临床使用。
[0007]本专利技术的一种技术方案中，所述试剂盒还包括定量标准品A、定量标准品B、定量标准品C、定量标准品D、第一阳性对照品、第二阳性对照品和阴性对照品。所述定量标准品A、所述定量标准品B、所述定量标准品C、所述定量标准品D为具有浓度梯度的四个不同浓度的含有目标基因的标准品，优选的一种技术方案中，所述定量标准品A、所述定量标准品B、所述定量标准品C、所述定量标准品D、所述第一阳性对照品和所述第二阳性对照品为含有乙型肝炎病毒核酸片段的重组质粒，所述定量标准品A、所述定量标准品B、所述定量标准品C、所述定量标准品D的浓度分别为5
×
106IU/ml、5
×
105IU/ml、5
×
104IU/ml、5
×
103IU/ml。本专利技术技术方案中，所述第一阳性对照品和所述第二阳性对照品为含有两种不同浓度目标基因的对照品，所述第一阳性对照品为强阳性对照品，选取范围为1.58
×
104~1.58
×
10
8 IU/mL，优选的技术方案中，所述第一阳性对照品浓度为1.58
×
105~1.58
×
10
6 IU/mL；所述第二阳性对照品为弱阳性对照品，选取范围为1.58
×
105~1.58
×
10
8 IU/mL，优选的技术方案中，所述第二阳性对照品浓度为158~1.58
×
10
4 IU/mL 。
[0008]本专利技术的一种技术方案中，所述内标为外源性克隆质粒，扩增目的DNA片段，内标引物探针为IC
‑
F、IC
‑
R、IC
‑
P，其中，IC
‑
F：5'AGATTTGGACCTGCGAGCG3'；IC
‑
R：5'GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3'；IC
‑
P：5'TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG3'。IC
‑
P为荧光探针。
[0009]本专利技术优选的技术方案中，PCR反应液可分为两部分PCR反应液A和PCR反应液B，其中，PCR反应液A包括dNTP、Mg
2+
、DNA聚合酶、UNG酶、和Tris
‑
Hcl缓冲液，PCR反应液B包括HBV
‑
F、HBV
‑
R、HBV
‑
P、IC
‑
F、IC
‑
R和IC
‑
P。在此技术方案中，UNG酶能够消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。
[0010]本专利技术一种技术方案中，所述HBV
‑
P的5
’
端，标记有荧光基团，所述HBV
‑
P在除 5
’
端外的任意一个位置上标记有淬灭基团。
[0011]所述HBV
‑
P的5
’
端的所述荧光基团选自6
‑
羧基荧光素、六氯
‑6‑
甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯
‑6‑
羧基荧光素、羧基
‑
X
‑
罗丹明、6
‑
羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6
‑
羧基
‑4’
,5
’‑
二氯
‑2’
,7
’‑
二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的至少一种；和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，包括PCR反应液和内标，其特征在于，所述PCR反应液包括乙型肝炎病毒靶基因的引物探针HBV
‑
F、HBV
‑
R和HBV
‑
P，所述PCR反应液还包括所述内标的基因的引物探针IC
‑
F、IC
‑
R和IC
‑
P，所述HBV
‑
P和所述YGNB
‑
P为荧光探针，其中，HBV
‑
F：5' GACAAACAGTATTACAGCATAGTTTTAATG 3'；HBV
‑
R：5'AGTTAGTTTGAGGATACCTTTGAATTATC3'；HBV
‑
P：5'CTGCCCACTCCGAATCGTGCTGACCAGTTTGA3'；IC
‑
F：5'AGATTTGGACCTGCGAGCG3'；IC
‑
R：5'GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3'；IC
‑
P：5'TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG3'。2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括定量标准品A、定量标准品B、定量标准品C、定量标准品D、第一阳性对照品、第二阳性对照品和阴性对照品。3.根据权利要求2所述的一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括dNTP、Mg
2+
、DNA聚合酶、UNG酶和Tris
‑
Hcl缓冲液。4.根据权利要求2所述的一种乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述HBV
‑
P的5
’
端标记有荧光基团，所述HBV
‑
P在除 5
’
端外的任意一个位置上标记有淬灭基团；所述HBV
‑
P的5
’
端的所述荧光基团选自6
‑
羧基荧光素、六氯
‑6‑
甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯
‑6‑
羧基荧光素、羧基
‑
X
‑
罗丹明、6
‑
羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：刘盼，李振海，刘海龙，聂彤彤，
申请(专利权)人：山东博弘基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：