用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物、试剂盒及方法。该试剂组合物包括CRISPR/Cas12a检测试剂，所述CRISPR/Cas12a检测试剂包括crRNA，所述crRNA能够特异性靶向如SEQ ID NO.1所示的靶核苷酸序列。本发明专利技术提供的用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物，能够基于CRISPR/Cas12a检测反应实现对GⅡ.6型诺如病毒的检测，具有耗时短、操作简单且不依赖大型实验设备等优势；而且，检测针对特定的靶核苷酸序列进行，该靶核苷酸序列在GⅡ.6型诺如病毒中具有高度保守性，这能够显著提升检测灵敏度和特异性。度和特异性。度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一种用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]诺如病毒(Norovirus，NoV)又名诺瓦克病毒，属于杯状病毒科诺如病毒属成员，是一种正链RNA病毒，基因组全长约7600bp。诺如病毒根据VP1氨基酸序列可被分成7个基因组型(G
Ⅰ‑
G
Ⅵ
I)，40多个基因亚型。其中GI型、GII型和GIV型可感染人类，GII型可进一步分为22个基因型。诺如病毒是一种重要的食源性病毒，能通过水源及贝类产品感染人类，造成急性胃肠炎。值得特别注意的是，经济贝类牡蛎是诺如病毒的主要传播媒介之一。尽管高温加热处理可以有效杀灭牡蛎中的诺如病毒，但这会破坏牡蛎的鲜美风味，致使人们易倾向于生食或轻微烹煮牡蛎。如果牡蛎中存在活的诺如病毒，就会增加人们感染诺如病毒的风险。
[0003]针对NoV导致的急性胃肠炎，目前尚无有效的疫苗和特效抗病毒药物。因此，建立准确、灵敏、快速的NoV检测方法对NoV感染的防控具有重要意义。目前，食品中诺如病毒的检测主要利用反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(Reverse transcription
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quantitative real
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time polymerase chain reaction，qRT
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PCR)，该方法操作繁琐，耗时长，工作量较大，且需要复杂的设备。
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技术实现思路

[0004]因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的诺如病毒检测方法存在操作繁琐、耗时长、工作量大且设备要求高的缺陷，从而提供一种用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物、试剂盒及方法。
[0005]为此，本专利技术提供一种用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物，该试剂组合物包括CRISPR/Cas12a检测试剂，所述CRISPR/Cas12a检测试剂包括crRNA，所述crRNA能够特异性靶向如SEQ ID NO.1所示的靶核苷酸序列。
[0006]可选地，所述crRNA包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0007]可选地，所述CRISPR/Cas12a检测试剂还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告分子、检测缓冲液以及无核酸酶水；
[0008]可选地，所述ssDNA报告分子包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
[0009]可选地，所述ssDNA报告分子的5
’
端连接有荧光基团，3
’
端连接有淬灭基团；
[0010]可选地，所述荧光基团为6
‑
羧基荧光素，所述淬灭基团为BHQ1；
[0011]可选地，所述检测缓冲液为NEB 2.1缓冲液；
[0012]可选地，所述crRNA的浓度为0.5～1μmol/L，所述Cas12a蛋白的浓度为1～2.5μmol/L，所述ssDNA报告分子的浓度为1～2μmol/L；
[0013]可选地，在所述CRISPR/Cas12a检测试剂中，所述crRNA的用量为1～10体积份，所述Cas12a蛋白的用量为1～4体积份，所述ssDNA报告分子的用量为2～4体积份。
[0014]可选地，所述试剂组合物还包括扩增试剂，所述扩增试剂包括能够特异性扩增所述靶核苷酸序列的引物对，所述引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物；
[0015]可选地，所述引物对为RT
‑
RAPID引物对。
[0016]可选地，所述扩增试剂还包括无核酸酶水、扩增缓冲液以及镁离子；
[0017]可选地，所述正向引物的浓度为8～10μmol/L，所述反向引物的浓度为8～10μmol/L，所述镁离子的浓度为280～300mmol/L；
[0018]可选地，在所述扩增试剂中，所述正向引物的用量为0.5～1体积份，所述反向引物的用量为0.5～1体积份，所述镁离子的用量为2～6体积份。
[0019]本专利技术还提供了一种用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂盒，该试剂盒包括上述所述的试剂组合物。
[0020]本专利技术还提供了上述所述的试剂组合物在制备用于GⅡ.6型诺如病毒检测的产品中的用途。
[0021]本专利技术还提供了一种非诊断目的的GⅡ.6型诺如病毒的检测方法，包括如下步骤：
[0022]利用上述所述的试剂组合物或者试剂盒，对待测样本的核酸样品进行CRISPR/Cas12a检测反应，并监测CRISPR/Cas12a检测反应过程中的荧光值与时间的关联关系；
[0023]在所述关联关系指示荧光值随时间增加而升高的情况下，确定所述待测样本中含有GⅡ.6型诺如病毒。
[0024]其中，检测结果指示所述待测样本中含有GⅡ.6型诺如病毒，则表明检测结果为阳性。在所述关联关系指示荧光值随时间增加呈稳定状态的情况下，确定所述待测样本中不含有GⅡ.6型诺如病毒，也即确定检测结果为阴性。
[0025]可选地，所述CRISPR/Cas12a检测反应的条件包括：反应温度为37～40℃，反应时间为20～30min。
[0026]可选地，在进行所述CRISPR/Cas12a检测反应之前，所述检测方法还包括对所述核酸样品进行RT
‑
RAPID扩增反应的步骤；
[0027]可选地，所述RT
‑
RAPID扩增反应的条件包括：反应温度为37～40℃，反应时间为20～30min。
[0028]本专利技术技术方案，具有如下优点：
[0029]1.本专利技术提供的用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物，能够基于CRISPR/Cas12a检测反应实现对GⅡ.6型诺如病毒的检测，具有耗时短、操作简单且不依赖大型实验设备等优势；而且，检测针对特定的靶核苷酸序列(SEQ ID NO.1)进行，该靶核苷酸序列在GⅡ.6型诺如病毒中具有高度保守性，这能够显著提升检测灵敏度和特异性。
[0030]2.本专利技术提供的用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物，crRNA包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该序列能够特异性识别SEQ ID NO.1所示的靶核苷酸序列，并且能够与Cas12a蛋白结合形成稳定的CRISPR/Cas12a
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crRNA复合物，再结合所述靶核苷酸序列，有效激活Cas12a蛋白的无差别的反式DNA切割活性，以实现对ssDNA报告分子的反式切割，这能够显著提升检测准确性。
[0031]3.本专利技术提供的GⅡ.6型诺如病毒的检测方法，在恒温条件下，全程1h内就能完成检测，而且对设备要求不高，只需简单的恒温设备即可使反应进行，有利于在硬件资源有限
的环境下开展核酸检测；同时，能够通过监测荧光值的变化情况，直观、快速地判断检测结果，能够显著简化检测过程、缩短检测流程、降低检测操作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于GⅡ.6型诺如病毒检测的试剂组合物，其特征在于，该试剂组合物包括CRISPR/Cas12a检测试剂，所述CRISPR/Cas12a检测试剂包括crRNA，所述crRNA能够特异性靶向如SEQ ID NO.1所示的靶核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述crRNA包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测试剂还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告分子、检测缓冲液以及无核酸酶水；可选地，所述ssDNA报告分子包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；可选地，所述ssDNA报告分子的5
’
端连接有荧光基团，3
’
端连接有淬灭基团；可选地，所述荧光基团为6
‑
羧基荧光素，所述淬灭基团为BHQ1；可选地，所述检测缓冲液为NEB 2.1缓冲液；可选地，所述crRNA的浓度为0.5～1μmol/L，所述Cas12a蛋白的浓度为1～2.5μmol/L，所述ssDNA报告分子的浓度为1～2μmol/L；可选地，在所述CRISPR/Cas12a检测试剂中，所述crRNA的用量为1～10体积份，所述Cas12a蛋白的用量为1～4体积份，所述ssDNA报告分子的用量为2～4体积份。4.根据权利要求1～3中任一项所述的试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物还包括扩增试剂，所述扩增试剂包括能够特异性扩增所述靶核苷酸序列的引物对，所述引物对包括如SEQ ID NO.4所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物；可选地，所述引物对为RT
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【专利技术属性】
技术研发人员：樊成，钱卫东，段勇，康婕，刘静，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：