一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法技术

本发明专利技术涉及一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法，属于生物学领域，本发明专利技术所述的引物序列如SEQ ID.1

【技术实现步骤摘要】
一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法


[0001]本专利技术属于生物学
，具体的说，涉及一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法。

技术介绍

[0002]月季(Rosa spp.)为常绿、半常绿低矮灌木，又名“月月红”、“玫瑰”，是我国五大主要切花之一，四季开花，花形优美，花期长，素有“花中皇后”的美称。月季切花产量占我国花卉产量的70％以上，创造了较高的经济价值，是目前极具竞争力和发展潜力的一种高经济价值的花卉，其在我国农村经济发展和乡村振兴建设中发挥着重要的作用。月季栽培通常为设施栽培，规模化生产种苗通常通过扦插繁殖来实现，长期无性繁殖导致病毒积累严重。苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus，CTLV)、李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)和月季C病毒(Rose virus C,RVC)是危害月季的四种主要病毒，在云南等月季主产区时有发生，据不完全调查，月季病毒病侵染率为20
‑
30％，严重的可高达70％，感染病毒后，严重影响了月季的观赏和经济价值，使植株表现出花叶、坏死、畸形、花瓣变色、不开花或花期缩短等症状，使其品质严重下降，已成为制约月季产业发展的主要限制因素。目前国际上还没有防治植物病毒病的有效药剂，因此，有针对性地进行隔离检疫、销毁病株，或培育无毒种苗等，是防控病毒病的重要措施。而这些都需要对种苗及植株进行病毒检测，建立快速、高效、成本低的检测方法显得尤为重要。
[0003]目前，月季批量化病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术(ELISA方法)，但抗血清不仅价格较高、一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，而且还存在一定程度的假阳性反应、检测灵敏性、准确度相对较低等问题。近年来，为了提高病毒检测效率，基于PCR技术的病毒检测技术迅速发展，但多为普通单重PCR检测技术，一个反应体系只能检测一种病毒。但田间环境复杂，导致病毒侵染多为2种或2种以上病毒的符合侵染，在实际田间多种病毒复合侵染的月季病毒检测实际应用中，单重PCR则存在耗时、耗力、费用高的问题。鉴于此，近年来，国内外研究者逐步将多重RT
‑
PCR技术运用到植物病毒检测，与单重PCR检测方法相比，多重PCR检测技术具有在一个RT
‑
PCR反应中可同时检测出多种病毒，操作更为简单，具有检测时间缩短、实验成本降低等优点，检测时间和成本均分别降低3/4左右，四个病毒检测时间在5小时内完成。目前尚未发现采用多重RT
‑
PCR检测技术同时检测月季植株组织中的ASGV、CTLV、PNRSV和RVC的相关文献报道。ASGV、CTLV、PNRSV和RVC多重同步检测的主要难点在于高扩增效率特异性引物的设计，反应体系的优化及反应程序的研究。

技术实现思路

[0004]为了克服
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供了一种同步检测月季四种病毒的引物及其方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0006]一种同步检测月季四种病毒的引物，其特征在于，包括四组引物对分别为：
[0007]苹果茎沟病毒引物对：
[0008]正向引物ASGV
‑
F：5
’‑
CTTTGCCGCTACTTCTA
‑3’
，
[0009]反向引物ASGV
‑
R：5
’‑
TAACCCTCCAGTTCCAG
‑3’
；
[0010]柑橘碎叶病毒引物对：
[0011]正向引物CTLV
‑
F：5
’‑
ATCTCAGAGGCAACACC
‑3’
，
[0012]反向引物CTLV
‑
R：5
’‑
AGTCACATTCCCATCCA
‑3’
；
[0013]李属坏死环斑病毒引物对：
[0014]正向引物PNRSV
‑
F：5
’‑
GATGAGATGAGGGCGTTAC
‑3’
，
[0015]反向引物PNRSV
‑
R：5
’‑
GCACTTCCTGAACTACCG
‑3’
；
[0016]月季C病毒引物对：
[0017]正向引物RVC
‑
F：5
’‑
ACTGACGCTGGCTTGTA
‑3’
，
[0018]反向引物RVC
‑
R：5
’‑
GGGTAACTTCTCGGTATGA
‑3’
。
[0019]本专利技术还提供使用一种同步检测月季四种病毒的引物检测月季四种病毒的方法，包含以下步骤：
[0020]S1，提取待测样品总RNA，经反转录为cDNA并以其为模板，同时设置RNase free ddH2O为空白对照；
[0021]S2，用所述的四组引物对对该四种病毒进行PCR扩增反应，得到PCR产物；
[0022]S3，将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
[0023]进一步的，所述的四组引物对的PCR产物分别为321bp、514bp、740bp和1072bp大小差异明显的四条扩增带。
[0024]进一步的，所述的S2步骤中，反应程序使用降落式PCR扩增：95℃预变性5min；94℃变性30s，65
‑
56℃退火30s，72℃延伸1min，10个循环，每个循环降1℃；后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸10min；4℃终止反应。
[0025]进一步的，所述的S2步骤中，PCR扩增的反应体系为：反应体系的总体积为50μL，含有1.25μL 5U/μL的ExTaq酶、5μL的10
×
Taq酶buffer、5μL 2.5mmol/L的dNTPs、每病毒cDNA模板50
‑
100ng、浓度为20μmol/L的苹果茎沟病毒正向引物ASGV
‑
F及反向引物ASGV
‑
R各0.75μL、浓度为20μmol/L的柑橘碎叶病毒正向引物CTLV
‑
F及反向引物CTLV
‑
R各0.75μL、浓度为20μmol/L的李属坏死环斑病毒正向引物PNRSV
‑
F及反向引物PNRSV
‑
R各1.0μL、浓度为20μmol/L的月季C病毒的正向引物RVC
‑
F及反向引物RVC
‑
R各0.5μL，加ddH2O补足至50μL。
[0026]本专利技术的有益效果：
[0027]针对苹本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同步检测月季四种病毒的引物，其特征在于，包括四组引物对分别为：苹果茎沟病毒引物对：正向引物ASGV
‑
F：5
’‑
CTTTGCCGCTACTTCTA
‑3’
，反向引物ASGV
‑
R：5
’‑
TAACCCTCCAGTTCCAG
‑3’
；柑橘碎叶病毒引物对：正向引物CTLV
‑
F：5
’‑
ATCTCAGAGGCAACACC
‑3’
，反向引物CTLV
‑
R：5
’‑
AGTCACATTCCCATCCA
‑3’
；李属坏死环斑病毒引物对：正向引物PNRSV
‑
F：5
’‑
GATGAGATGAGGGCGTTAC
‑3’
，反向引物PNRSV
‑
R：5
’‑
GCACTTCCTGAACTACCG
‑3’
；月季C病毒引物对：正向引物RVC
‑
F：5
’‑
ACTGACGCTGGCTTGTA
‑3’
，反向引物RVC
‑
R：5
’‑
GGGTAACTTCTCGGTATGA
‑3’
。2.使用如权利要求1所述的引物检测月季四种病毒的方法，其特征在于：包含以下步骤：S1，提取待测样品总RNA，经反转录为cDNA并以其为模板，同时设置RNase free ddH2O为空白对...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀梅，王丽花，孙爱青，张艺萍，许凤，杨舒琪，张丽芳，苏艳，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，
类型：发明
国别省市：