一种从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法技术

本申请提供了一种从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法，包括如下步骤：步骤一：在痰液中加入其2倍质量的质量分数为4%的NaOH溶液，使用拍击式均质器9次/s，均质10min，得一级处理液；步骤二：在所述一级处理液中加入其10倍质量的无菌水，使用静态混合器混合7min，得二级处理液；步骤三：在所述二级处理液中加入其0.12倍质量的核酸释放辅助剂，使用鼓泡反应器搅拌19min得三级处理液；所述鼓泡反应器使用气体为辛基苯基聚氧乙烯醚，所述气体的温度为277℃；步骤四：将所述三级处理液在12000r/min下，离心3min，取上清，得结核分枝杆菌DNA溶液。本申请提供的提取结核分枝杆菌DNA的方法，能够从痰液中有效提取结核分枝杆菌DNA、灭活结核分枝杆菌且有效去除人源DNA的干扰。核分枝杆菌且有效去除人源DNA的干扰。

【技术实现步骤摘要】
一种从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法


[0001]本申请涉及核酸提取
，尤其涉及一种从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌(M.tuberculosis)俗称为结核杆菌。结核分枝杆菌能通过受损的皮肤、呼吸道和消化道入侵机体,引起全身各器官的结核病,其中肺结核最为常见。据报道,每年约有800万人感染结核分枝杆菌,至少有300万人死亡,对人类健康威胁较大。目前主要依靠实验室诊断和临床体症相结合对结核病作出诊断。早诊断、早发现、早治疗是控制结核病蔓延的有效措施。现有几种检测结核病的方式如直接涂片染色镜检、培养法、解剖实验、PCR扩增技术和ELASA等。传统的结核病诊断从根本上依赖于抗酸杆菌(AFB)涂片显微镜和选择固体培养基上的分枝杆菌培养，但这些方法都存在局限性。首先,AFB涂片的敏感性低(30
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40%),其准确性往往受到限制。其次,虽然以培养为基础的方法具有很高的准确性,长期以来一直被认为是实验室结核病诊断的金标准，但分枝杆菌培养的周转时间长(3
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8周)往往导致诊断延迟。
[0003]近年来,随着荧光定量PCR技术的不断发展,受到众多科研工作者的重视，已成为检测结核分枝杆菌基因水平的方法之一。然而，PCR技术需要首先将待测核酸释放出来，对于结核分枝杆菌来说，其提取环境往往是在人的痰液中，痰液可增强结核分枝杆菌的抵抗力，（因大多数消毒剂可使痰中的蛋白质凝固，包在细菌周围，使细菌不易被杀死），因此当前急需一种从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术目的是提供一种从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法，包括如下步骤：步骤一：在痰液中加入其2倍质量的质量分数为4%的NaOH溶液，使用拍击式均质器9次/s，均质10min，得一级处理液；步骤二：在所述一级处理液中加入其10倍质量的无菌水，使用静态混合器混合7min，得二级处理液；步骤三：在所述二级处理液中加入其0.12倍质量的核酸释放辅助剂，使用鼓泡反应器搅拌19min得三级处理液；所述鼓泡反应器使用气体为辛基苯基聚氧乙烯醚，所述气体的温度为277℃；步骤四：将所述三级处理液在12000r/min下，离心3min，取上清，得结核分枝杆菌DNA溶液。如此设置，4%的NaOH配合本申请中拍击式均质器特有的均质条件，有效混合痰液和碱液，破坏掉人源DNA和其他干扰DNA；使用静态混合器在本申请的条件下能够充分稀释一级处理液并终止碱反应；核酸释放辅助剂在本申请步骤三包括之后的反应条件下保护核酸，277℃的辛基苯基聚氧乙烯醚通过本申请中鼓泡反应器释放出来，冲击打散剩余痰液并
使痰液中的蛋白质变性沉降，杀死结核分枝杆菌并释放结核分枝杆菌DNA，且混匀体系为下一步对三级处理液的处理做准备。
[0005]进一步地，在所述步骤二中：所述无菌水的温度为33℃。如此设置，既不会使结核分枝杆菌增殖，又避免了结核分枝杆菌休眠使荚膜增厚，不便于配合下一步处理。
[0006]进一步地，在所述步骤二中：所述静态混合器混合的流速为41m3/h。如此设置，使痰液组织受到足够的剪切力而进一步分散且不会过度摩擦产热使痰液变性而堵塞静态混合器。
[0007]进一步地，在所述步骤三中：核酸释放辅助剂为质量分数为1%的海藻糖、质量分数为3%的氢氧化钾、质量分数为2%的氯化钾、质量分数为1%的甜菜碱、质量分数为4%的牛血清白蛋白、质量分数为2%的乙二胺四乙酸、质量分数为1.7%的乙基苯基聚乙二醇、质量分数为1.3%的聚环氧乙烷山梨糖醇单月桂酸酯和质量分数为2%的Tris
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HC1，剩余质量分数用0.9%质量浓度的生理盐水补足。如此设置，提供了一个合适的裂解环境，还抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏和维持核酸结构的稳定，配合277℃的辛基苯基聚氧乙烯醚气泡使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸稳定游离在裂解体系中。
[0008]进一步地，所述步骤三中：鼓泡反应器的反应条件为47℃，2.7Pa。如此设置，一方面快速降温277℃的辛基苯基聚氧乙烯醚气泡，不使其破坏已经释放的核酸，另一方面延长了气泡存在的时间，起到更好的混匀效果。
[0009]进一步地，所述步骤三中：气体流速为0.4m/s。如此设置，起到了适合的温度和混合效果。
[0010]通过本申请能够带来如下有益效果：本申请提供的提取结核分枝杆菌DNA的方法，能够从痰液中有效提取结核分枝杆菌DNA、灭活结核分枝杆菌且有效去除人源DNA的干扰。
实施方式
[0011]此处为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式对本专利技术的整体方案进行详细说明；在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本专利技术更为彻底的理解；然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本专利技术可以无需一个或多个这些细节而得以实施；在其他的例子中，为了避免与本专利技术发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
[0012]本申请中拍击式均质器购自北京优晟联合科技有限公司，型号UBM
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400E；静态混合器购自上海重野实业有限公司，型号SY，规格SD
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10/20。
[0013]如未特殊说明，下述实施例中各原料组分均可通过商业途径购得，所使用的实验仪器均为实验室常规实验仪器，性能测试方法为本领域已知测试方法。
[0014]优选的实施方式如下：步骤一：在痰液中加入NaOH溶液，均质得一级处理液；步骤二：在一级处理液中加入无菌水，混合得二级处理液；步骤三：在二级处理液中加入核酸释放辅助剂，搅拌得三级处理液；步骤四：将三级处理液离心取上清，得结核分枝杆菌DNA溶液。
实施例
[0015]步骤一：在痰液中加入其2倍质量的质量分数为4%的NaOH溶液，使用拍击式均质器9次/s，均质10min，得一级处理液；步骤二：在一级处理液中加入其10倍质量的无菌水，使用静态混合器混合7min，得二级处理液；无菌水的温度为33℃，静态混合器混合的流速为41m3/h；步骤三：在二级处理液中加入其0.12倍质量的核酸释放辅助剂，使用鼓泡反应器搅拌19min得三级处理液；鼓泡反应器使用气体为辛基苯基聚氧乙烯醚，气体的温度为277℃；核酸释放辅助剂为质量分数为1%的海藻糖、质量分数为3%的氢氧化钾、质量分数为2%的氯化钾、质量分数为1%的甜菜碱、质量分数为4%的牛血清白蛋白、质量分数为2%的乙二胺四乙酸、质量分数为1.7%的乙基苯基聚乙二醇、质量分数为1.3%的聚环氧乙烷山梨糖醇单月桂酸酯和质量分数为2%的Tris
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HC1，剩余质量分数用0.9%质量浓度的生理盐水补足；鼓泡反应器的反应条件为47℃，2.7Pa，气体流速为0.4m/s；步骤四：将三级处理液在12000r/min下，离心3min，取上清，得结核分枝杆菌DNA溶液。
[0016]实施例2
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8实施例2与实施例1的区别仅在于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一：在痰液中加入其2倍质量的质量分数为4%的 NaOH溶液，使用拍击式均质器9次/s，均质10min，得一级处理液；步骤二：在所述一级处理液中加入其10倍质量的无菌水，使用静态混合器混合7min，得二级处理液；步骤三：在所述二级处理液中加入其0.12倍质量的核酸释放辅助剂，使用鼓泡反应器搅拌19min得三级处理液；所述鼓泡反应器使用气体为辛基苯基聚氧乙烯醚，所述气体的温度为277℃；步骤四：将所述三级处理液在12000r/min下，离心3min，取上清，得结核分枝杆菌DNA溶液。2.根据权利要求1所述的从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法，其特征在于，在所述步骤二中：所述无菌水的温度为33℃。3.根据权利要求1所述的从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的方法，其特征在于，在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢清华，刘海龙，张爱苓，刘盼，
申请(专利权)人：山东博弘基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：