一种全血中总RNA提取的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了全血中总RNA提取的试剂盒及其方法，试剂盒由裂解液A，裂解液B，裂解液C和清洗液A、清洗液B组成，其中：裂解液A为由2～4.5M的异硫氰酸胍、5～25％的曲拉通、0.01～0.05M的盐酸、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成的混合液，裂解液B为由2～4.5M的异硫氰酸胍、5～25％的曲拉通、0.01～0.1M的氢氧化钠、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷组成的混合液，裂解液C为由2～4.5M的异硫氰酸胍、10～30％的曲拉通、0.01～0.1M的盐酸、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成的混合液，清洗液A为2～5M的盐酸胍、50～70％的乙醇和10～30％的曲拉通组成的混合液，清洗液B为75～90％的乙醇和5～30％的曲拉通组成的混合液。本发明专利技术还提供应用上述试剂盒提取全血总RNA的方法。本发明专利技术无须进行红细胞裂解即可提取全血中总RNA，操作更简便。本试剂盒的搭配可以提高本提取试剂盒样本处理上样量范围，可最大程度防止磁性微球因过度调节而导致的结团现象。调节而导致的结团现象。调节而导致的结团现象。

【技术实现步骤摘要】
一种全血中总RNA提取的试剂盒及其方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种全血中总RNA提取的试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]目前市面上提取血液中全血总RNA(核醣核酸)方法一般为先进行红细胞裂解后分离出血液中的白细胞后，再进行细胞裂解及核酸纯化。目前普遍使用的RNA的抽提方法是苯酚
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氯仿抽提法，但缺点为：1.需要有受过专业培训人员进行操作；2.需要至少1ml以上的正常人类血液才能保证成功率。经过材料科学的进步之后演化出：柱提法及磁珠法抽提法，上述两种方法的试剂盒目前皆为手提试剂盒且无法兼容自动化提取流程，并且最大血样上量为1.5ml正常人类全血，在操作上会导致样本提取的纯度及片段都不佳的情况。

技术实现思路

[0003]为了解决上述
技术介绍
中存在的技术问题，本专利技术提供了一种全血中总RNA提取的试剂盒及其方法。
[0004]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0005]一种全血中总RNA提取的试剂盒，由裂解液A，裂解液B，裂解液C和清洗液A、清洗液B组成，其中：
[0006]裂解液A为由2～4.5M的异硫氰酸胍、5～25％的曲拉通、0.01～0.05M的盐酸、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成的混合液，
[0007]裂解液B为由2～4.5M的异硫氰酸胍、5～25％的曲拉通、0.01～0.1M的氢氧化钠、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷组成的混合液，
[0008]裂解液C为由2～4.5M的异硫氰酸胍、10～30％的曲拉通、0.01～0.1M的盐酸、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成的混合液，
[0009]清洗液A为2～5M的盐酸胍、50～70％的乙醇和10～30％的曲拉通组成的混合液，
[0010]清洗液B为75～90％的乙醇和5～30％的曲拉通组成的混合液。
[0011]进一步地，裂解液A的PH值为3
‑
6。
[0012]进一步地，裂解液B的PH值为8
‑
11。
[0013]进一步地，裂解液C的PH值为4
‑
7。
[0014]一种全血中总RNA的提取方法，包括如下步骤：
[0015]S1.取一干净的无酶管，全血比液以1:1.5～1.6方式加入权利要求1所述的裂解液B在15～37℃下混合5～10min；
[0016]S2.在步骤S1的混合液中加入1:0.6的权利要求1所述的裂解液A在15～37℃下混合5～10min；
[0017]S3.在步骤S2的混合液中加入粒径为150nm～500nm的带有COOH或OH基团的磁性小球，在15～37℃下混合5～10min；
[0018]S4.将步骤S3混合物放置于磁铁边上或市售磁座上，进行磁性分离后去除上清液；
[0019]S5.将步骤S4中分离的磁珠放置于权利要求1所述的裂解液C中混和5～10min之后进行磁性分离；
[0020]S6.将步骤S5分离的磁珠放置于清洗液A中进行磁混合使之分散，后进行磁性分离；
[0021]S7.将步骤S6分离的磁珠放置于清洗液B中进行磁混合使之分散，后进行磁性分离；
[0022]S8.将步骤S7分离的磁珠放置于清洗液A进行磁混合使之分散，后进行磁性分离；
[0023]S9.将步骤S8分离的磁珠放置于清洗液B进行磁混合使之分散,后进行磁性分离；
[0024]S10.将步骤S9分离的磁珠与50～200u无酶水，混合后进行45～60℃孵育10～15min并于每5min混合一次使磁珠均于分散。
[0025]申请人在进行白血病患者的血液样本及骨随血液样本进行提取纯化总RNA时发现，白血病患者的血液及骨随样本含有不成熟的芽球细胞，此种血液样本与正常人类样本的血液样本的差异点是含有较多无用的白血病细胞(血癌细胞)。因此进行细胞裂解时因整体细胞含量较大会释放出较多凝胶类物质，导致利用磁性微球再进行核酸回收时回受到凝胶类物质干扰。为了将此凝胶类物质进行分解，申请人经过多次反复研究，尝试多种方法之后发现提高酸碱值可破坏分解凝胶类物质的结构，但因为RNA分子的结构特性，无法存在于高酸碱值的环境中，所以需要立即进行酸碱中和来保护RNA分子，因此申请人设定了不同酸碱值的裂解液来实现即可保护RNA分子又可分解凝胶类物质。白血病患者因为血液中含有较多不成熟的芽球细胞，需要在较高酸碱值的环境下破坏分解凝胶类物质的结构，因此磁性微球被放置在核酸与蛋白含量较高的环境中进行作用，考虑到磁性微球会同时结合蛋白及核酸，因此必须考虑到蛋白质清洁问题才可以纯化出较高质量的核酸样本，因此申请人选择了不同的中性清洗液。
[0026]同时，在磁性微球进行核酸的结合过程中磁性微球不只吸附核酸还会吸附蛋白质及盐类，故须透过清洗液进行蛋白得清洁及盐类的去除才可以保证核酸溶液的质量及纯度，另外提取RNA时通常会有基因组DNA污染所以需要利用DNase核酸酶进行基因组DNA的降解但DNase为蛋白质且易受盐类物质干扰活性，因此申请人设计清洗液(A、B)先将样本裂解液中所吸附的盐类清除后再利用DNase与但有核酸的磁性微球作用后再与清洗液(C、D)混和清洗与酶作用后的所吸附的蛋白质及盐类。
[0027]本专利技术提取全血中总RNA的原理是：由于RNA较容易受到RNase核酸降解酶作用，因此全血总RNA的提取需使用具有强效的蛋白质活性抑制能力的化学物质，目前红细胞裂解液选择性裂解红细胞，其独特的裂解液/β
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巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗
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离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从磁性微球上洗脱。本方法提供了一种独特裂解液的搭配可以分解蛋白质凝胶类物质又可以保护RNA完整性并且不会造成红细胞破裂变质结块，干扰磁性微球与核酸分子结合，透过不同成分的蛋白质清洗液及盐离子去除液进行磁性微球的清洗之后再将磁性微球与无酶水进行混和将RNA分子洗脱。
[0028]相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0029]1.本方法无须进行红细胞裂解即可提取全血中总RNA，操作上更简便。
[0030]2.本试剂盒裂解液A及裂解液B的搭配可以提高本提取试剂盒样本处理上样量范围。
[0031]3.本试剂盒裂解液与清洗液搭配可最大程度防止磁性微球因过度调节而导致的结团现象。
[0032]4.本试剂盒可手动操作也可搭配Concertbio HF系列移液式自动化提取仪，实现全血直接上机提取全血中的总RNA。
[0033]5.可实现一性取样提取。
[0034]6.本试剂盒可以在1ml血液中纯化出3ug总RN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全血中总RNA提取的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由裂解液A，裂解液B，裂解液C和清洗液A、清洗液B组成，其中：所述裂解液A为由2～4.5M的异硫氰酸胍、5～25％的曲拉通、0.01～0.05M的盐酸、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成的混合液，所述裂解液B为由2～4.5M的异硫氰酸胍、5～25％的曲拉通、0.01～0.1M的氢氧化钠、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷组成的混合液，所述裂解液C为由2～4.5M的异硫氰酸胍、10～30％的曲拉通、0.01～0.1M的盐酸、0.1～0.2M的乙二胺四乙酸和1～2M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成的混合液，所述清洗液A为2～5M的盐酸胍、50～70％的乙醇和10～30％的曲拉通组成的混合液，所述清洗液B为75～90％的乙醇和5～30％的曲拉通组成的混合液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液A的PH值为3
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6。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液B的PH值为8
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11。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液C的PH值为4

【专利技术属性】
技术研发人员：温书纬，洪旭伟，张育弦，林翰，官振群，
申请(专利权)人：恺硕生物科技厦门股份有限公司，
类型：发明
国别省市：