高产苏氨酸工程菌的构建方法技术

本发明专利技术提供一种高产苏氨酸工程菌的构建方法。本发明专利技术将天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸/醌氧化还原酶菌株联合用于棒杆菌(如谷氨酸棒状杆菌)的L

【技术实现步骤摘要】
高产苏氨酸工程菌的构建方法


[0001]本专利技术属于微生物工程
，具体地说，涉及一种高产苏氨酸工程菌的构建方法。

技术介绍

[0002]L
‑
苏氨酸(L
‑
Threonin)，化学名称β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基丁酸，分子式C4H9NO3，相对分子质量为119.12。L
‑
苏氨酸是一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等诸多方面。
[0003]谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB)以及苏氨酸合酶(thrC)编码。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷氨酸棒状杆菌的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback
‑
resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228
‑
3230)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145
‑
163)。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling通过弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,et al.Identification of glyA(Encoding Serine Hydroxymethyltransferase)and Its Use Together with the Exporter ThrE To Increase l
‑
Threonine Accumulation by Corynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(7):3321
‑
3327)。
[0004]目前利用谷氨酸棒状杆菌生产L
‑
苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，丙酮酸
‑
草酰乙酸代谢节点与合成途径组合等方面的报道较少，且现有报道仅对L
‑
苏氨酸合成路径做了初步研究，并未形成系统。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种高产苏氨酸工程菌的构建方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术通过加强苏氨酸合成路径中的酶同时加强前体的供应使菌株生产L
‑
苏氨酸的能力得到提升。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。
[0008]优选地，天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮
酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶在NCBI上的参考序列编号分别为WP_011013497.1、WP_003855724.1、WP_003854900.1、WP_011014964.1、WP_011013816.1、WP_011014465.1、WP_011014814.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
[0009]优选地，酶的活性的增强是由选自以下1)～5)，或任选的组合实现的：
[0010]1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
[0011]2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
[0012]3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
[0013]4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
[0014]5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强。
[0015]进一步地，天冬氨酸氨基转移酶活性的增强是通过在aspB基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的。
[0016]进一步地，天冬氨酸激酶活性的增强是通过在lysC基因起始密码子上游插入sod启动子，并将lysC基因起始密码子由GTG突变为ATG、其编码蛋白的第311位氨基酸由T突变为I来实现的。
[0017]进一步地，高丝氨酸脱氢酶活性的增强是通过在hom基因起始密码子上游插入cspB启动子，并将hom基因编码蛋白的第378位氨基酸由G突变为E来实现的。
[0018]进一步地，苏氨酸合酶活性的增强是通过在thrC基因起始密码子上游插入sod启动子，并将thrC基因起始密码子由GTG突变为ATG。
[0019]进一步地，丙酮酸羧化酶活性的增强是通过在pyc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将pyc基因编码蛋白的第458位氨基酸由P突变为S来实现的。
[0020]进一步地，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的增强是通过在ppc基因起始密码子上游插入tuf启动子，并将ppc基因编码蛋白的第299位氨基酸由D突变为N来实现的。
[0021]进一步地，苹果酸/醌氧化还原酶活性的增强是通过在mqo基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的。
[0022]优选地，本专利技术所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，谷氨酸棒状杆菌包括ATCC13032、ATCC13870、ATCC13869、ATCC21799、ATCC21831、ATCC14067、ATCC13287等(参见NCBI Corunebacterium glutamicum进化树https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/469)，更优选谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。
[0023]第二方面，本专利技术提供高产苏氨酸工程菌的构建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，增强具有氨基酸生产能力的棒杆菌中的基因aspB、lysC、hom、thrC、pyc、ppc和mqo，获得天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和苹果酸/醌氧化还原酶的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；6)通过对酶的编码基因的核苷酸序列进行改变而增强。3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，天冬氨酸氨基转移酶活性的增强是通过在aspB基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的；和/或天冬氨酸激酶活性的增强是通过在lysC基因起始密码子上游插入sod启动子，并将lysC基因起始密码子由GTG突变为ATG、其编码蛋白的第311位氨基酸由T突变为I来实现的；和/或高丝氨酸脱氢酶活性的增强是通过在hom基因起始密码子上游插入cspB启动子，并将hom基因编码蛋白的第378位氨基酸由G突变为E来实现的；和/或苏氨酸合酶活性的增强是通过在thrC基因起始密码子上游插入sod启动子，并将thrC基因起始密码子由GTG突变为ATG；和/或丙酮酸羧化酶活性的增强是通过在pyc基因起始密码子上游插入sod启动子，并将pyc基因编码蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：