一种高产D-泛解酸的基因工程菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产D

【技术实现步骤摘要】
一种高产D
‑
泛解酸的基因工程菌及应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种高产D
‑
泛解酸的基因工程菌及其构建方法，以及该工程菌在微生物发酵制备D
‑
泛解酸中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]泛酸，也称为维生素B5，是辅酶A的组成成分之一，在能量代谢以及柠檬酸循环等重要生化反应中起到关键作用。因此，作为一种重要的维生素及前体物质，D
‑
泛酸在饲料、医药以及化妆品等方面得到广泛应用。
[0003]泛解酸是合成D
‑
泛酸的重要前体，D
‑
泛解酸结构不稳定，易形成D
‑
泛酰内酯，一般以D
‑
泛酰内酯的形式存在。目前D
‑
泛酰内酯的生产方法主要有三种，化学法生产泛酰内酯，酶法生产泛酰内酯，生物发酵法生产泛酰内酯。化学法生产泛酰内酯是目前的主流方法，技术相对成熟，但是化学法生产泛酰内酯过程中对设备损耗大，同时还存在高能耗、环境污染以及手性拆分剂价格昂贵等问题；酶法生产泛酰内酯在化学法生产的基础上，用生物酶代替有毒且价格昂贵的手性拆分剂，虽然比化学法在安全性上有所提高，在成本上有所降低，但是前期合成的高能和污染问题仍没有合理的解决；介于这些方法的局限性及存在的环境问题，越来越多的研究者开始关注逐渐成熟的生物发酵法。
[0004]微生物发酵法生产D
‑
泛解酸是一种环境友好的绿色生产方法，不仅对生产设备要求较低，且成本低廉，具有相当广阔的发展前景。因此，构建一株更高产的D
‑
泛解酸菌株仍是一大挑战。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术目的是利用理性代谢工程和基因编辑技术，提供一种高产D
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泛解酸的基因工程菌以及该基因工程菌在微生物发酵制备D
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泛解酸中的应用，解决了化学法合成D
‑
泛解酸高污染、高耗能，高成本问题及酶催化合成D
‑
泛解酸需要昂贵的酶拆分试剂和繁琐操作步骤问题。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]本专利技术提供一种高产D
‑
泛解酸的基因工程菌，所述基因工程菌是将枯草芽孢杆菌来源的乙酰乳酸合酶基因(alsS)，通过中高拷贝质粒pTrc99A
‑
panB使其在底盘菌PAL1中过表达，得到高产D
‑
泛解酸的基因工程菌，记为菌株PAL3；所述底盘菌PAL1即为W3110Trc
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PanE/Trc
‑
panB/Trc
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ilvC/Trc
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lpd/Trc
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pck/Trc
‑
ilvG
*
/Trc
‑
macB/Trc
‑
ilvB/Δglk/ΔilvA/ΔavtA/ΔilvE/ΔpanC/ΔcoaA
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，已在专利CN 113416744 A中公开。
[0008]优选的，所述乙酰乳酸合酶基因(alsS)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供一种所述基因工程菌在发酵产D
‑
泛解酸中的应用，所述应用的方法为：将所述基因工程菌接种至含有卡那霉素抗性的摇瓶发酵培养基，在30℃、180
‑
200rpm条件下发酵培养至OD
600
＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.2mM的IPTG，之后在30℃，180
‑
200rpm下继续培养48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D
‑
泛解酸；所述摇瓶发酵培养基组
成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO
4 20g/L、KH2PO40.25g/L、MgSO
4 0.2g/L、酵母粉2g/L、CaCO
3 15g/L，溶剂为水。
[0010]本专利技术所述卡那霉素抗性终浓度为50mg/L。
[0011]通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至含50mg/L的Kan抗性的LB培养基中，于37℃、200rpm的摇床上过夜培养，之后以体积浓度2％接种量接种到摇瓶发酵培养基中进行发酵培养。
[0012]优选的，所述发酵培养采用发酵罐按如下步骤进行：(1)将所述基因工程菌划线于含Kan抗性的LB平板中，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养；从平板中挑选单菌落于含Kan抗性的LB试管中，置于37℃，200rpm恒温摇床中培养12h；菌液按体积浓度1％的接种量接种至含Kan抗性的LB培养基中，置于37℃、200rpm恒温摇床中培养12h，获得种子液；(2)将发酵培养基中葡萄糖、硫酸铵、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁和盐溶液加入发酵罐，115℃灭菌后通过氨水补碱瓶调节罐内pH至6.2，将种子液和发酵培养基其余组分利用火圈法接种至装有发酵培养基的发酵罐中，向发酵培养基中加入终浓度50mg/L的Kan和1mM的IPTG，再通过氨水补碱瓶调节罐内pH至6.8，开始发酵，设置发酵温度为30℃，转速400rpm，通过转速调整维持溶氧为20％
‑
30％；发酵过程通过补料瓶流加含50mg/L Kan和1mM的IPTG的补料培养基，将残糖控制在0
‑
5g/L，发酵结束后，将发酵液分离纯化，获得D
‑
泛解酸；
[0013]所述发酵罐中发酵培养基组成：葡萄糖20g/L，硫酸铵20g/L，酵母粉3g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，盐溶液1mL/L，2mg/L的VB
12
水溶液1ml/L、5mg/L的VB1水溶液1ml/L、40g/L异亮氨酸水溶液1ml/L、300g/L氯化钙水溶液1mL/L，消泡剂1.5mL/L，溶剂为蒸馏水；
[0014]所述补料培养基组成：葡萄糖500g/L、磷酸二氢钾14g/L、酵母粉2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁8g/L、盐溶液2mL/L、2mg/L的VB
12
水溶液1ml/L、5mg/L的VB1水溶液1ml/L、40g/L异亮氨酸水溶液1ml/L、300g/L氯化钙水溶液2ml/L、溶剂为水；
[0015]盐溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·
7H2O、1g/L ZnSO4·
7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·
7H2O，溶剂为水。
[0016]优选的，所述溶氧控制方法为，当溶氧低于20％时开始上调转速50rpm，发酵后期可上调25rpm。
[0017]与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：
[0018]本专利技术通过引入枯草芽孢杆菌来源的乙酰乳酸合酶基因(alsS)，解决大肠杆菌自身乙酰乳酸合酶基因(ilvGMBNIH)存在的反馈抑制问题。强化了D
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泛解酸合成途径中关键本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产D
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泛解酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将枯草芽孢杆菌来源的乙酰乳酸合酶基因alsS在底盘菌PAL1中过表达，得到高产D
‑
泛解酸的基因工程菌；所述底盘菌PAL1为W3110Trc
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PanE/Trc
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panB/Trc
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ilvC/Trc
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lpd/Trc
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pck/Trc
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ilvG
*
/Trc
‑
macB/Trc
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ilvB/Δglk/ΔilvA/ΔavtA/ΔilvE/ΔpanC/ΔcoaA
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。2.如权利要求1所述的高产D
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泛解酸的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合酶基因alsS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种权利要求1所述基因工程菌在发酵产D
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泛解酸中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将所述基因工程菌接种至含有卡那霉素抗性的摇瓶发酵培养基，在30℃、180
‑
200rpm条件下发酵培养至OD
600
＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.2mM的IPTG，之后在30℃，180
‑
200rpm下继续培养48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D
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泛解酸；所述摇瓶发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO
4 20g/L、KH2PO
4 0.25g/L、MgSO40.2g/L、酵母粉2g/L、CaCO
3 15g/L，溶剂为水。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌发酵前，先接种至含50mg/L的Kan抗性的LB培养基中，于37℃、200rpm的摇床上过夜培养，之后以体积浓度2％接种量接种到摇瓶发酵培养基中进行发酵培养。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：金利群，陈逸楚，王子文，柳志强，周海岩，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：