一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体公开了一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用。本发明专利技术的修饰的棒状杆菌属微生物为尿嘧啶磷酸核糖转移酶失活或活力降低的棒状杆菌。进一步相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。本发明专利技术的修饰的棒状杆菌属微生物可更好地提升苏氨酸的产量。量。

【技术实现步骤摘要】
一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物工程
，具体地说，涉及一种修饰的棒状杆菌属微生物及其构建方法与在生产苏氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]L
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苏氨酸(L
‑
Threonin)，化学名称为β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12。L
‑
苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
[0003]谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷棒菌株的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback
‑
resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228
‑
3230.)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145
‑
163.)。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling在该领域进行了进一步的探索，弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,et al.Identification of glyA(Encoding Serine Hydroxymethyltransferase)and Its Use Together with the Exporter ThrE To Increasel
‑
Threonine Accumulation by Corynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(7):3321
‑
3327.)。
[0004]但目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，尚未见嘧啶代谢与苏氨酸合成相关的报道。仍有必要对谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸进行进一步研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是通过失活尿嘧啶磷酸核糖转移酶使菌株生产苏氨酸的能力得到提升，从而提供一种产苏氨酸(L
‑
苏氨酸)菌株及其构建方法与应用。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其尿嘧啶磷酸核糖转移酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。优选地，尿嘧啶磷酸核糖转移酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003858289.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
[0007]进一步地，所述微生物体内尿嘧啶磷酸核糖转移酶的活性降低或丧失是通过降低
编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的表达或敲除内源的编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因来实现的。
[0008]可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的表达或敲除内源的编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因。
[0009]进一步地，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成和/或前体供应途径相关的酶的活性增强；其中，与所述苏氨酸合成和/或前体供应途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、苏氨酸合酶中的至少一种；优选地，它们在NCBI上的参考序列编号分别为WP_003855724.1、WP_011013506.1、WP_003854900.1、WP_011014183.1、WP_011013816.1、WP_011014465.1、WP_011013497.1、WP_011014964.1，或与上述参考序列相似度为90％的氨基酸序列。
[0010]优选地，所述微生物为如下
①
～
⑥
中的任一种：
[0011]①
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶和/或高丝氨酸激酶活性增强的微生物；
[0012]②
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强的微生物；
[0013]③
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性增强的微生物；
[0014]④
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或天冬氨酸氨基转移酶活性增强的微生物；
[0015]⑤
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或苏氨酸合酶活性增强的微生物；
[0016]⑥
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和/或苏氨酸合酶活性增强的微生物。
[0017]所述微生物体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：
[0018]1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
[0019]2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
[0020]3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
[0021]4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
[0022]5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
[0023]6)通过对编码酶的基因的核苷酸序列进行改变而增强。
[0024]优选地，本专利技术所述棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Coryne本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其尿嘧啶磷酸核糖转移酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内尿嘧啶磷酸核糖转移酶的活性降低或丧失是通过降低编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的表达或敲除内源的编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因来实现的。3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的表达或敲除内源的编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因。4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成和/或前体供应途径相关的酶的活性增强；其中，与所述苏氨酸合成和/或前体供应途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、苏氨酸合酶中的至少一种。5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为如下
①
～
⑥
中的任一种：
①
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶和/或高丝氨酸激酶活性增强的微生物；
②
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强的微生物；
③
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性增强的微生物；
④
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或天冬氨酸氨基转移酶活性增强的微生物；
⑤
尿嘧啶磷酸核糖转移酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和/或苏氨酸合酶活性增强的微生物；
⑥
尿嘧啶磷酸核糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，王治权，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：