苏氨酸生产菌株的构建方法技术

本发明专利技术提供一种苏氨酸生产菌株的构建方法。本发明专利技术通过对苏氨酸合成及还原力供应相关的多个酶进行叠加修饰，包括天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶、果糖

【技术实现步骤摘要】
苏氨酸生产菌株的构建方法


[0001]本专利技术属于微生物工程
，具体地说，涉及一种苏氨酸生产菌株的构建方法。

技术介绍

[0002]L
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苏氨酸(L
‑
Threonin)，化学名称β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基丁酸，分子式C4H9NO3，相对分子质量119.12。L
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苏氨酸是一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
[0003]谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB)以及苏氨酸合酶(thrC)编码。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷氨酸棒状杆菌的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback
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resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228
‑
3230)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145
‑
163)。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling通过弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,et al.Identification of glyA(Encoding Serine Hydroxymethyltransferase)and Its Use Together with the Exporter ThrE To Increase l
‑
Threonine Accumulation by Corynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(7):3321
‑
3327)。
[0004]目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，关于还原力供应等方面的报道较少，且现有报道仅对苏氨酸合成路径做了初步研究，并未形成系统。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种苏氨酸生产菌株的构建方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术通过对苏氨酸合成相关的多个酶进行叠加修饰，包括天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶、果糖
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1,6
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二磷酸酶2、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶、变异链球菌来源的NADP依赖性甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶、转酮酶、NAD激酶等，系统地增强苏氨酸合成路径，从而提高菌株生产苏氨酸的能力。
[0007]第一方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其与苏氨酸合成和还原力供应途径相关的酶活性增强，，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。
[0008]其中，与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合
酶；与还原力供应相关的酶选自、果糖
‑
1,6
‑
二磷酸酶2、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、变异链球菌来源的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶、6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、NAD激酶中的至少一种。
[0009]优选地，天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶、果糖
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1,6
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二磷酸酶2、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、NAD激酶在NCBI上的参考序列编号分别为WP_011013497.1、WP_003855724.1、WP_011014964.1、WP_003856830.1、NP_600790.1、NP_600669.1、NP_600788.1、NP_600631.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
[0010]变异链球菌来源的gapN基因在NCBI上的参考序列编号为FOB93_04945，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
[0011]优选地，酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：
[0012]1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
[0013]2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
[0014]3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
[0015]4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；
[0016]5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；
[0017]6)通过改变编码上述酶的核苷酸序列而增强。
[0018]所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶、果糖
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1,6
‑
二磷酸酶2、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶和NAD激酶活性增强，且在微生物体内过表达变异链球菌来源的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶。
[0019]进一步地，天冬氨酸氨基转移酶活性的增强是通过在aspB基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的。
[0020]进一步地，天冬氨酸激酶活性的增强是通过在lysC基因起始密码子上游插入sod启动子，同时将起始密码子GTG突变为ATG，并将lysC基因编码的第311位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸来实现的。
[0021]进一步地，苏氨酸合酶活性的增强是通过在thrC基因起始密码子上游插入sod启动子，并将起始密码子GTG突变为ATG来实现的。
[0022]进一步地，果糖
‑
1,6
‑
二磷酸酶2活性的增强是通过在fbp基因起始密码子上游插入tuf启动子来实现的。
[0023]进一步地，葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶活性的增强是通过在zwf基因起始密码本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其与苏氨酸合成途径相关的酶活性增强，且与还原力供应相关的酶的活性增强，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力；其中，与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶；与还原力供应相关的酶选自果糖
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1,6
‑
二磷酸酶2、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、变异链球菌来源的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶、NAD激酶中的至少一种。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，酶活性增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；6)通过改变编码上述酶的核苷酸序列而增强。3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内天冬氨酸转氨酶、天冬氨酸激酶、苏氨酸合酶、果糖
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1,6
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二磷酸酶2、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、6
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磷酸葡萄糖酸脱氢酶、转酮酶和NAD激酶活性增强，且在微生物体内过表达变异链球菌来源的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶。4.根据权利要求3所述的微生物，其特征在于，天冬氨酸氨基转移酶活性的增强是通过在aspB基因起始密码子上游插入sod启动子来实现的；和/或天冬氨酸激酶活性的增强是通过在lysC基因起始密码子上游插入sod启动子，同时将起始密码子GTG突变为ATG，并将lysC基因编码的第311位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸来实现的；和/或苏氨酸合酶活性的增强是通过在thrC基因起始密码子上游插入sod启...

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，吴涛，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：