苦参组织培养与快速繁殖方法技术

提供苦参组织培养与快速繁殖方法，以苦参茎尖、地上茎和地下茎为外植体进行组织培养，成功诱导出试管苗。将外植体接种在ＭＳ＋２，４－Ｄ０．２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．８ｍｇ／Ｌ培养基上，诱导率高达１００％，有大量愈伤组织产生，颜色为淡绿色，生长较快；用ＭＳ＋ＩＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ诱导从生芽增殖及分化时，增殖系数可达７．３，芽分化系数达８．３倍；用１／２ＭＳ＋ＩＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ或１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１．０ｍｇ／Ｌ进行生根培养，生根率高达９５％，平均根数６条以上，在一定的温度和湿度条件下培养，移栽成活率可达８７％以上。

【技术实现步骤摘要】

.-本专利技术属于生物技术组织培养领域，具体地，涉及苦参的组织培养与 快速繁殖方法。 技术背景苦参0Sop/zora y av^ce似Ait.)为豆科槐属落叶灌木，中国约有12 种,集中分布于北方沙漠地区。英文名称Lighiyellow Sophora Root又称苦 骨、苦槐、水槐、地槐、野槐、白茎、虎麻、禄白、陵郎、川参等。根圆 柱形，外皮黄色。茎杆绿色，有稀疏细毛。叶互生，为奇数羽状复叶，小 叶对生，长椭圆形，全缘先端尖或钝，叶面绿色，背面苍白色，总状花序， 腋生或顶生，花蝶形，淡黄色。果实为荚果，内含黑色种子2 6枚，种 子含油为14.7%。荚长圆柱形，先端长，成熟后黑褐色，不开裂。种子1 5粒，淡褐色，长圆柱形，花期5 6月，果期7 9月。苦参是我国传统中药，《本草纲目》中既有记载:其药用部分为根，具 有清热、祛湿、杀虫、利尿之功效。苦参的有效成分中研究较为成熟的是 生物碱及黄酮类化合物，生物碱(matrine)具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等 功效；黄酮提取物具有清热、杀虫、利尿、祛湿等作用。目前已经被开发 成各类药物，用来治疗癌症、肝炎、急性炎症等多种疾病；在农业上也有 广泛的用途，对多种害虫和病菌有抑制作用；苦参可以治各种牲畜病害， 也是畜牧业生产中绿色饲料的首选添加剂。此外，苦参又是良好的抗风沙、 耐盐碱植物。苦参野生资源越来越少，而市场需求越来越大，人工种植以播种繁殖 为主，但种子发芽率低和遗传分化问题严重。利用组织培养技术，不仅可 保留原有植株的优良性状，而且将优良单株快速繁殖成无性系，可在生产 中推广。迄今，现有技术中未见有苦参组织培养方面的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在筛选和确定苦参组培快繁过程中影响愈伤组织、增殖分化 和生根的主要因素，提供成熟可靠的苦参组织培养方法，为解决资源短缺 提供一条可行的途径。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案来实现的-苦参的组织培养方法，包括外植体消毒、诱导、继代、生根培养，移载步骤，取苦参茎尖或地上茎或地下茎，洗净，75。/。的酒精处理30s， 0.1% 升汞浸泡8min，再用无菌水清洗4 5次，晾干，切成每段0.5cm带1 2 个芽，接入MS+2,4-D0.2mg/L+6-BA0.8mg/L中进行愈伤组织诱导，将愈 伤组织分割成3 5mm2的小段，插入MS+IBA0.1mg /L+6-BA1.5mg/L培养 基中，以每25d—个周期进行继代培养，进行从生芽增殖及分化，然后将 高3cm的再生芽从芽簇上切下，接入生根培养基1/2MS+IBA1.5mg/L或 1/2MS+NAA1.0mg/L中，生根后的植株移栽到温室1:1的腐殖土+蛭石中； 上述培养基中蔗糖质量浓度，除生根培养为15 g/L外，均为30g/L，琼脂 质量浓度为8g/L，培养基pH5.8 6.2，配制好的培养基在1.05MPa 121°C 条件下灭菌20min;培养条件为温度22 28'C ，每日光照时间10 12 h， 光照强度1500 3 000 Lx;在弱光500 1000Lx条件下诱导不定根。其中移载温室腐殖土和蛭石在使用前先在12rC下高压灭菌2h，移载 前7天，用1/2MS大量元素与清水隔日浇灌，移载7天后，改用清水浇灌， 移栽4周后在自然条件下常规管理。具体实施例方式下面用本专利技术的实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以 此来限定本专利技术。 实施例1: 苦参的组织培养 1材料与方法 1.1材料 l丄l试材初级培养时，选用苦参茎尖、地上茎和地下茎为外植体，研究培养基 和激素对苦参芽体增殖及分化的影响时，外植体均为无菌苗的茎尖或茎 段。l丄2试剂组成MS培养基的各成分、萘乙酸(NAA)、 6-苄基嘌呤(6-BA)、吲哚丁 酸(IBA)、 2,4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、 2%NaC10、 0.P/。HgCl等。 1.2方法1.2.1外植体的消毒在自来水下冲洗30s，放在盛有适量水的烧杯里，用毛笔蘸肥皂并搅 拌，重复2次，然后用清水冲洗干净。挑选出较嫩茎尖、地上茎和地下茎， 分别在无菌超净工作台上用三种方式灭菌..(1)2y。NaC10浸泡8min; (2) 0.1。/。HgCl浸泡8min; (3) 75%的酒精处理30s， 0.1%HgCl浸泡8min。以 上消毒过程每间隔30s轻摇一次，消毒完成后，使用无菌水清洗4 5次， 放到无菌滤纸上晾干，每段切约0.5cm (带1 2个芽)，用于初代培养。1.2.2愈伤组织诱导采用易于诱导愈伤组织的MS培养基，探索生长素和细胞分裂素不同 配比对愈伤组织诱导的影响。本文选择细胞分裂素6-BA，取量分别为0.5、 1.0、 2.0、 3.0mg/L;生长素2,4-D、 NAA和IBA，取量为0.2mg/L。设置对 照MSo,筛选出适宜的生长素和细胞分裂素组合，在进一步试验出最适苦 参外植体愈伤组织诱导的组合用量配比。培养30d后，观察愈伤组织生长 情况并统计诱导率。1.2.3从生芽增殖及分化将生长较好的愈伤组织分割成3 5mm2的小段，正向插于新的芽诱导 培养基中，以每25d —个周期进行继代培养。采用MS培养基+6-BA+IBA， 为探索激素浓度对芽增殖和分化的影响，做了 3因素3水平正交实验设计， 共9次处理(表2)。培养25d后，观察外植体的生长情况并统计增殖系数 及芽分化率。本试验继代3次,每次转代时间为培养后25天。1.2.4试管苗生根及移栽将高3cm左右的再生芽从芽簇上切下，接入生根培养基(1) 1/2MS+IBA， IBA取O、 1.0、 1,5、 2.0 mg/L， (2) 1/2MS+NAA， NAA取 1.0、 1.5、 2.0mg/L， 30d后统计生根率及生根芽的平均根数;生根之后的 完整小植株移栽到温室腐殖土+蛭石(1: 1)上。1.2.5培养基及培养条件培养基中蔗糖质量浓度(除生根培养15 g/L外)均为30g/L，琼脂质 量浓度为8g/L，培养基pH 5.8 6.2，配制好的培养基在1.05MPa(12rC) 条件下灭菌20min，灭菌后的培养基平放于工作台上，冷却备用。将接种 的培养材料放在培养室的培养架上培养。培养条件为温度22 28'C ，每日光照时间10 12 h，光照强度1500 3 000 Lx;在弱光(500 1000Lx)条件下诱导不定根。试验中所有处理都是每处理4次重复，每次重复4瓶， 每瓶5棵，即每个处理数为20。1.2.6数据分析以上试验均采用单因子对比试验(除外植体的消毒)，培养一定天数后统计并计算所需数据。采用DPS软件进行回归、差异显著性等数据等分 析。2、结果与分析2.1不同消毒方法对外植体污染率的影响不同消毒剂和消毒方法对外植体污染率的影响很大，污染率6.1% 16.7%，处理1 3的污染率逐渐下降。从表1看出，第3种消毒方式的污染 率最低，为6.1%，可得出0.P/。HgCl消毒效果比2y。NaClO消毒效果好，多 种消毒剂结合使用，能够更好地降低污染率。表1不同消毒方式对外植体污染率的影响 Tab 1. Different sterilization methods on the impact of explantscontamination ra本文档来自技高网...

【技术保护点】
苦参的组织培养方法，包括外植体消毒、诱导、继代、生根培养，移载步骤，取苦参茎尖或地上茎或地下茎，洗净，７５％的酒精处理３０ｓ，０．１％升汞浸泡８ｍｉｎ，再用无菌水清洗４～５次，晾干，切成每段０．５ｃｍ带１～２个芽，接入ＭＳ＋２，４－Ｄ　０．２ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ　０．８ｍｇ／Ｌ中进行愈伤组织诱导，将愈伤组织分割成３～５ｍｍ↑［２］的小段，插入ＭＳ＋ＩＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ培养基中，以每２５ｄ一个周期进行继代培养，进行从生芽增殖及分化，然后将高３ｃｍ的再生芽从芽簇上切下，接入生根培养基１／２ＭＳ＋ＩＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ或１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１．０ｍｇ／Ｌ中，生根后的植株移栽到温室１∶１的腐殖土＋蛭石中；上述培养基中蔗糖质量浓度，除生根培养为１５ｇ／Ｌ外，均为３０ｇ／Ｌ，琼脂质量浓度为８ｇ／Ｌ，培养基ｐＨ　５．８～６．２，配制好的培养基在１．０５ＭＰａ１２１℃条件下灭菌２０ｍｉｎ；培养条件为温度２２～２８℃，每日光照时间１０～１２ｈ，光照强度１５００～３０００Ｌｘ；在弱光５００～１０００Ｌｘ条件下诱导不定根。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄家林，程爱华，严宁，胡虹，康志钰，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]