一种新型的抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种新型的抗TGF

【技术实现步骤摘要】
一种新型的抗TGF
‑
β
单克隆抗体生物学活性的检测方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体地，本专利技术涉及一种新型的抗TGF
‑
β单克隆抗体生物学活性的检测方法，更具体地，本专利技术涉及一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞及其在检测抗TGF
‑
β单克隆抗体药物生物学活性中的应用。

技术介绍

[0002]转化生长因子β(Transforming growth factorβ，TGF
‑
β)是一种广泛存在的细胞因子，几乎每个细胞都具有分泌TGF
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β、应答TGF
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β的能力。在上皮细胞中，TGF
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β在肿瘤的早期具有肿瘤抑制作用，而在晚期具有促进作用。TGF
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β信号通路是一个包含众多成员的多功能细胞因子的大家族，包括骨形成蛋白、生长分化因子、激活素、抑制素，TGF
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β配体有3个亚型，分别为TGF
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β1、TGF
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β2和TGF
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β3。TGF
‑
β作为一种广泛存在的细胞因子，在细胞的生长、黏附、运动、增殖、分化、迁移、凋亡和免疫调节等多种细胞进程中都发挥着重要的作用，参与介导组织与器官的生长和发育、机体的免疫反应等生物过程。
[0003]TGF
‑
β在肿瘤的早期表现出对肿瘤的抑制作用，而在肿瘤的晚期则转变为对肿瘤具有促进作用。随着肿瘤的发展，肿瘤细胞常会对TGF
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β调节的生长抑制功能缺失应答，但却可以充分利用TGF
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β的肿瘤促进作用。首先，TGF
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β信号可作用于肿瘤微环境中的免疫细胞，抑制效应性T细胞和天然杀伤细胞的细胞毒性，进而减弱了肿瘤微环境中固有免疫细胞的抗肿瘤能力，还能促进肿瘤逃逸免疫监管；其次，TGF
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β信号可以通过诱导HMGA2、Snail1/2等转录因子的表达，诱发上皮
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间质转化(Epithelial
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mesenchymal transition，EMT)，进而逃逸凋亡作用；另外，TGF
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β表达上调，也会促进VEGF
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A等因子的分泌，刺激新生血管生成，从而促进癌细胞的生长和转移。
[0004]在肿瘤治疗中，抗TGF
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β策略的研究已经进入到了临床前研究阶段。目前的主要途径是应用抗TGF
‑
β单克隆抗体药物。抗TGF
‑
β单克隆抗体药物的优点是其具有高度特异性，并且能够在细胞外发挥作用，利用这一特性可以扫除细胞外的配体，并且相对于静脉内的递送方式更加便捷。如诺华(Novartis)近日在中国获批临床的NIS793，礼来公司(Eli Lilly and Company)开发的galunisertib，目前均已进入临床中期或后期。劲方医药的GFH018片剂和璎黎药业的YL
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13027目前正在开展1期临床试验。在临床应用前，对单克隆抗体类药物进行生物学活性检测是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。
[0005]目前常用的抗体类药物的生物学活性的检测方法主要有ELISA、表面等离子共振(SPR)和细胞增殖抑制法。ELISA和SPR虽然操作简单，灵敏度高，但是不能提供生物学效应的信息，且方法耐用性和重复性较差；而细胞增殖抑制方法实验周期长，变异性大。随着抗TGF
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β单克隆抗体药物的快速发展，迫切需要一种高效、快速、准确、特异性强的生物学活性检测方法。鉴于此，本专利技术经过多种细胞株的筛选和研究开发出了一种新型的抗TGF
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β单克隆抗体生物学活性的检测方法，该方法快速准确，专属性强，可用于抗TGF
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β单克隆抗体的研制和质量控制中。

技术实现思路

[0006]为了解决目前本领域缺乏一种快速准确、专属性强的抗TGF
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β单克隆抗体生物学活性的检测方法这一技术问题，本专利技术提供了一种新型的抗TGF
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β单克隆抗体生物学活性的检测方法。
[0007]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞的构建方法。
[0009]进一步，所述方法包括如下步骤：
[0010](1)构建PGL4.48(SBE)质粒；
[0011](2)将步骤(1)中所述的质粒转染到4T1细胞中；
[0012](3)对步骤(2)得到的经转染后的细胞进行筛选，获得阳性克隆4T1
‑
SBE细胞即为稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞；
[0013]优选地，步骤(2)中所述转染的方式为电转染法。
[0014]进一步，所述PGL4.48(SBE)质粒购自于Promega公司。
[0015]进一步，步骤(3)中所述的筛选包括如下步骤：
[0016](a)使用潮霉素B进行筛选获得稳定表达SBE的混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株；
[0017](b)通过预实验筛选得到阳性克隆细胞株；
[0018]优选地，步骤(a)中所述的潮霉素B的浓度分别为100μg/mL；
[0019]优选地，步骤(b)中所述的预实验包括：固定步骤(a)得到的单克隆细胞株的接种数目，在细胞培养板中将单克隆细胞株分别与不同浓度的TGF
‑
β抗原混合，进行培养，荧光检测筛选得到阳性克隆细胞株；
[0020]更优选地，所述接种数目为5
×
104/孔；
[0021]更优选地，所述不同浓度的TGF
‑
β抗原为50ng/mL的TGF
‑
β抗原、0ng/mL的TGF
‑
β抗原；
[0022]最优选地，所述TGF
‑
β抗原为TGF
‑
β1抗原；
[0023]更优选地，所述培养的条件为37℃、5％ CO2；
[0024]更优选地，所述培养的时间为6h。
[0025]本专利技术所述的抗TGF
‑
β单克隆抗体药物生物学活性的检测方法的原理如下：本专利技术首先构建了一种稳定表达SBE和荧光素酶的效应细胞4T1
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SBE，在TGF
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β抗原的刺激下，TGF
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β抗原与4T1
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SBE细胞细胞膜上的TGF
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β受体结合后形成复合体，进而与4T1
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SBE细胞中的SBE结合，驱动荧光素酶报告基因的表达，加入抗TGF
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β的单克隆抗体药物阻断TGF
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β刺激激活的信号通路，加入荧光底物后产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建PGL4.48(SBE)质粒；(2)将步骤(1)中所述的质粒转染到4T1细胞中；(3)对步骤(2)得到的经转染后的细胞进行筛选，获得阳性克隆4T1
‑
SBE细胞即为稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞；优选地，步骤(2)中所述转染的方式为电转染法。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的筛选包括如下步骤：(a)使用潮霉素B进行筛选获得稳定表达SBE的混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株；(b)通过预实验筛选得到阳性克隆细胞株；优选地，步骤(a)中所述的潮霉素B的浓度分别为100μg/mL；优选地，步骤(b)中所述的预实验包括：固定步骤(a)得到的单克隆细胞株的接种数目，在细胞培养板中将单克隆细胞株分别与不同浓度的TGF
‑
β抗原混合，进行培养，荧光筛选得到阳性克隆细胞株；更优选地，所述接种数目为5
×
104/孔；更优选地，所述不同浓度的TGF
‑
β抗原为50ng/mL的TGF
‑
β抗原、0ng/mL的TGF
‑
β抗原；最优选地，所述TGF
‑
β抗原为TGF
‑
β1抗原；更优选地，所述培养的条件为37℃、5％CO2；更优选地，所述培养的时间为6h。3.一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求1或2所述的构建方法构建得到的。4.一种抗TGF
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β单克隆抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞；(2)用TGF
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β刺激激活步骤(1)得到的4T1细胞中报告基因的表达；(3)将抗TGF
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β单克隆抗体加入到步骤(2)得到的4T1细胞中，进行孵育；(4)加入荧光底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定抗TGF
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β单克隆抗体的生物学活性；优选地，步骤(1)中所述的稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞采用权利要求1或2所述的构建方法构建得到的。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的TGF
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β的浓度为1ng/mL；优选地，步骤(2)中所述的步骤(1)得到的4T1细胞的接种密度为5
×
104/孔。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的抗TGF
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β单克隆抗体初始浓度为300μg/mL、3倍梯度稀释；优选地，步骤(3)中所述孵育的...

【专利技术属性】
技术研发人员：付志浩，钟欣，刘春雨，杨雅岚，于传飞，王兰，王军志，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：