引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型，构建方法包括：将如SEQ ID NO.3所示的sgRNA1和Cas9mRNA和如SEQ ID NO.1所示的Elavl4打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；将如SEQ ID NO.4所示的sgRNA3、Cas9mRNA和如SEQ ID NO.2所示的Elavl2打靶载体混合后显微注射到所述F0代小鼠中，获得Elavl2

【技术实现步骤摘要】
引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的构建方法。

技术介绍

[0002]RNA结合蛋白在基因转录后调控过程发挥着重要的作用。神经元Elav蛋白可作为神经元的分子标记物，靶向结合RNA并介导RNA的出核、可变剪切、转录和翻译等过程来调节神经元的发育。nElavls与脆性X综合征、神经母细胞瘤、脊髓侧索硬化症及阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等多种神经退行性疾病的发生发展密切相关。有研究报道nElavls仅表达于早期分化的斑马鱼视网膜神经元如神经节细胞和无长突细胞中。
[0003]Elavl2是nElavls家族中重要的成员，虽然目前的研究中并未直接动物模型证明Elavl2在神经系统中的作用机制，但有研究发现，在神经系统发育过程中Elavl2 mRNA最早表达于小鼠胚胎期16天的脑室区神经元祖细胞中，且Elavl2与中间神经元祖细胞标记物Tbr2有共定位，表明Elavl2在神经元祖细胞中发挥作用。除此之外，Elavl2还可拮抗microRNA
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9对转录因子Foxg1的抑制作用，调节前脑细胞的增殖和分化。对精神分裂症家系样本进行的全基因组关联分析表明Elavl2是精神分裂症的易感基因，在红藻酸诱导的小鼠癫痫模型中发现，CA3椎体神经元中Elavl2蛋白和靶向GAP
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43mRNA的水平急剧下降，提示Elavl2的表达受神经元活性的调节。以上研究表明Elavl2与精神分裂症与大脑功能异常相关。
[0004]Elavl4是nElavls家族中第一个被成功克隆的成员，它参与神经元的增殖、分化和神经突的生长等过程。之前的研究证明，Elavl4促进GAP
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43、c
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fos、P21waf1、N
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myc和tau基因的mRNA稳定性和蛋白的表达，正向调节神经元突起的形成和再生。Elavl4基因的缺失会导致运动神经元的轴突分支和海马区CA3锥体神经元的树突减少；在背根神经节损伤模型中抑制Elavl4的表达，会导致轴突的再生能力下降。此外，Elavl4选择性表达于新皮层和海马的兴奋性谷氨酸能神经元，而不表达与抑制性γ
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氨基丁酸能的中间神经元中，因而Elavl4可能参与神经元兴奋性的形成。
[0005]因此，有必要开发一种Elavl2、Elavl4特异性敲除模型小鼠，用于探索神经元RNA结合蛋白Elavl2和Elavl4在视网膜发育过程中发挥的作用。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型及其构建方法，成功获得引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除的模式小鼠。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的模式小鼠的打靶载体，所述打靶载体包括：
[0008]Elavl4打靶载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]Elavl2打靶载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]在本专利技术的第二方面，提供了一种用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的特异性靶位点导向RNA，包括：
[0011]sgRNA1，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0012]sgRNA3，所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]在本专利技术的第三方面，提供了一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的构建方法，所述方法包括：
[0014]将如SEQ ID NO.3所示和Cas9质粒分别体外转录成有活性的sgRNA1和Cas9 mRNA；
[0015]将所述有活性的sgRNA1、Cas9 mRNA和如SEQ ID NO.1所示的Elavl4打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；
[0016]将如SEQ ID NO.4所示的sgRNA3体外转录成有活性的sgRNA3；
[0017]将所述有活性的sgRNA3、Cas9 mRNA和如SEQ ID NO.2所示的Elavl2打靶载体混合后显微注射到所述F0代小鼠中，获得Elavl2
fl/fl
Elavl4
fl/fl
小鼠，使其与视网膜特异性敲除工具鼠Six3
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Cre进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得引起视网膜无长突细胞特异性减少的模式小鼠。
[0018]在本专利技术的第四方面，提供了一种用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的小鼠模型的成套核酸分子，所述成套核酸分子包括：
[0019](a)所述的用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的特异性靶位点导向RNA；
[0020](b)所述的打靶载体。
[0021]在本专利技术的第五方面，提供了采用所述的方法获得的用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的小鼠模型。
[0022]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0023]我们采用了基于CRISPR/Cas9开发的EGE(Extreme Genome Editing system)系统制备小鼠模型，可将基因敲进效率提高近20倍、且快速、便捷，提高了成功率，节约了成本，缩短了周期，更有利于工业化及大规模的商业应用。最终得到Elavl2
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Elavl4
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；Six3特异性敲除模型小鼠，用于探索神经元RNA结合蛋白Elavl2和Elavl4在视网膜发育过程中发挥的作用。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0025]图1为Elavl4的打靶载体图谱；
[0026]图2为Elavl2的打靶载体图谱；
[0027]图3为sgRNA体外转录的RNA电泳图；
[0028]图4为转基因小鼠模型构建之后，分别在DNA水平上进行视网膜特异性Elavl2和Elavl4敲除验证(A、B)；以及RNA水平验证视网膜内基因敲除效率(C、D)，证明敲除模型构建
成功。
[0029]图5为基因敲除成年小鼠视网膜细胞数量变化观察，结果为视网膜无长突细胞特异性减少(A、B)，相应AP2α的mRNA表达水平也下降(C)；
[0030]图6为Elavl2及Elavl4视网膜特异性敲除后成年小鼠的暗适应视功能分析发现b波振幅下降约30％(A)，暗适应a波波幅未出现明显下降(B)。在1、3、8个月本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的模式小鼠的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包括：Elavl4打靶载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；Elavl2打靶载体，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的特异性靶位点导向RNA，其特征在于，包括：sgRNA1，所述sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；sgRNA3，所述sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将如SEQ ID NO.3所示和Cas9质粒分别体外转录成有活性的sgRNA1和Cas9 mRNA；将所述有活性的sgRNA1、Cas9 mRNA和如SEQ ID NO.1所示的Elavl4打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；将如SEQ ID NO.4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈吟，于垚，胡西塔尔，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：