一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法技术

本发明专利技术属于水产生物基因工程领域，具体为一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法，包括以下步骤：S1、栉孔扇贝基因组DNA提取；S2、栉孔扇贝ef1α启动子序列的扩增；S3、ef1α启动子序列确认；S4、ef1α启动子序列与tdTomato

【技术实现步骤摘要】
一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法


[0001]本专利技术属于水产生物基因工程领域，具体是一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法。

技术介绍

[0002]外源基因导入是基因工程的一个关键步骤，是对重要基因进行功能验证并解析相关生物学机制的重要手段，目前主要包括物理、化学以及生物方法。物理方法包括电穿孔、基因枪、显微注射等；化学方法包括磷酸钙、纳米粒子介导等方法；生物方法有农杆菌转化法和病毒转染法。各类外源基因导入技术在应用过程中具备各自的优缺点，例如显微注射技术成功率较高，但其操作繁琐、耗时费力、对设备和操作要求很高；病毒介导的转染适用性受限较大，具有一定的安全隐患；脂质体转染对细胞的毒性较大。而电穿孔转染作为一种物理方法，可以在大多数细胞中进行开展，并且具有操作简便、通量高、省时高效等特点，是一种比较优秀的外源基因导入手段。然而目前对于利用电穿孔技术在海洋双壳贝类中进行外源基因导入的研究仍不成熟，相关技术体系尚未构建完成，阻碍了贝类基因功能验证技术及新育种技术的开发。
[0003]栉孔扇贝(Chlamys farreri)属于软体动物门，双壳纲，扇贝科，扇贝属，是我国北方沿海重要的养殖贝类，其产量大，经济价值高。它是雌雄异体动物，性别较稳定，是研究贝类性别决定与分化机制的良好生物模型。目前针对双壳类动物尚未有报道可用的电穿孔转染体系。本专利技术使用电穿孔法将构建的栉孔扇贝启动子－报告基因载体导入卵子，构建了扇贝卵子外源基因导入体系，为双壳贝类功能基因验证和转基因技术平台的建立提供了方法。
[0004]因此，针对上述问题提出一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法。

技术实现思路

[0005]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种栉孔扇贝卵子外源基因导入的方法，旨在解决无法实现贝类外源基因导入、无法进行功能验证的困难。
[0006]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0007]1)筛选并构建不同“ptdTomato
‑
ef1α启动子”荧光表达载体，使用HEK293T细胞转染筛选高表达活性的荧光载体；
[0008]2)将载体和卵子混合，对电穿孔条件中的电压，脉冲时间，脉冲次数等几个关键参数进行选取和组合，使用BIORAD Gene Pulser Xcell电穿孔仪将荧光表达载体/报告基因mRNA转入栉孔扇贝的卵子，于受精后48h根据胚胎荧光效率筛选最佳电转条件。
[0009]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：包括以下步骤：
[0010]S1、栉孔扇贝基因组DNA提取；
[0011]S2、栉孔扇贝ef1α启动子序列的扩增；
[0012]S3、ef1α启动子序列确认；
[0013]S4、ef1α启动子序列与tdTomato
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1载体连接；
[0014]S5、细胞转染筛选高转录活性的启动子；
[0015]S6、电穿孔将报告基因载体/mRNA导入栉孔扇贝卵子。
[0016]优选的，所述步骤S1中取栉孔扇贝雌贝性腺冻存样，液氮研磨混样后使用天根DP304基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0017]优选的，所述步骤S2中以栉孔扇贝基因组DNA为模板，使用Takara Gflex高保真酶按照不同引物进行不同长度启动子扩增。
[0018]优选的，所述步骤S3中将扩增的启动子序列使用1.2％琼脂糖凝胶电泳，使用上海生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段回收。
[0019]优选的，所述步骤S6中电穿孔将载体导入栉孔扇贝卵子的具体方法为：
[0020]A.取性腺发育良好的雌性、雄性成熟栉孔扇贝，干燥避光处阴干流水刺激栉孔扇贝排放配子，借助显微镜观察精卵形态和活力，500目筛绢富集栉孔扇贝的形态圆润、卵黄均匀饱满的卵子，并收集足量的游动能力良好的精子；
[0021]B.使用极距4mm的电转杯进行电穿孔，每个电转杯内加入电转缓冲液(50ml 2
×
L
‑
15基础培养基，25ml NaCl，1ml谷氨酰胺，ddH2O补齐至100ml)、卵子及载体，至最终体积为200μl，吹打混匀后，使用BIORAD Gene Pulser Xcell电转仪进行电穿孔，每个条件设置三个重复，空白对照组不进行电穿孔；
[0022]C.通过电压、脉冲次数、脉冲时长、脉冲间隔、载体浓度、电转缓冲液渗透压不同参数的组合优化栉孔扇贝卵子电穿孔条件，同时对各条件下栉孔扇贝胚胎孵化率进行统计；
[0023]D.提取65％渗透压电转缓冲液组电穿孔和对照组幼虫基因组DNA，利用不同引物进行PCR扩增，结果阴性对照无条带，阳性对照(ptdTomato
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ef1α2834载体)及实验组有条带且大小正确，表明通过电穿孔可以成功将外源DNA转入栉孔扇贝卵子中；
[0024]E.使用Invitrogen mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA体外转录试剂盒进行tdTomato报告基因mRNA的转录，并采用栉孔扇贝卵子最适电穿孔条件将mRNA电转栉孔扇贝卵子，获得电穿孔效率为19.8
±
0.56％。
[0025]优选的，所述栉孔扇贝卵子最适电穿孔条件如下：电压50V，脉冲时长10ms，脉冲次数4次，脉冲间隔1s，电转杯极距为4mm，ptdTomato
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ef1α2834载体浓度30μg/ml，电转缓冲液稀释渗透压65％，获得电穿孔效率为11.1
±
0.33％。
[0026]本专利技术的有益之处在于：
[0027]1.筛选出含有高转录活性栉孔扇贝基因启动子的荧光表达载体；
[0028]2.首次开展栉孔扇贝卵子电穿孔转染技术的研究，获得栉孔扇贝卵子最适电穿孔条件：电压为50V，脉冲时长为10ms，脉冲次数为4次，脉冲间隔为1s，电转杯极距为4mm，ptdTomato
‑
ef1α2834载体浓度为30μg/ml，卵子密度为1.0
×
106个/ml，电转缓冲液稀释为65％，所得载体电穿孔效率为11.1
±
0.33％；
[0029]3.采用上述同样电穿孔条件将体外转录tdTomato mRNA成功转入栉孔扇贝卵子，所得mRNA电穿孔效率为19.8
±
0.56％。本专利技术建立了栉孔扇贝卵子电穿孔转染体系。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0031]图1为本专利技术栉孔扇贝ef1α基因结构简图；
[0032]图2为本专利技术ef1α启动子目的片段扩增凝胶电泳图；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、栉孔扇贝基因组DNA提取；S2、栉孔扇贝ef1α启动子序列的扩增；S3、ef1α启动子序列确认；S4、ef1α启动子序列与tdTomato
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1载体连接；S5、细胞转染筛选高转录活性的启动子；S6、电穿孔将报告基因载体/mRNA导入栉孔扇贝卵子。2.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法，其特征在于：所述步骤S1中取栉孔扇贝雌贝性腺冻存样，液氮研磨混样后使用天根DP304基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。3.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法，其特征在于：所述步骤S2中以栉孔扇贝基因组DNA为模板，使用Takara Gflex高保真酶按照不同引物进行不同长度启动子扩增。4.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法，其特征在于：所述步骤S3中将扩增的启动子序列使用1.2％琼脂糖凝胶电泳，使用上海生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段回收。5.根据权利要求1所述的一种栉孔扇贝卵子的电穿孔转染方法，其特征在于：所述步骤S6中电穿孔将载体导入栉孔扇贝卵子的具体方法为：A.取性腺发育良好的雌性、雄性成熟栉孔扇贝，干燥避光处阴干流水刺激栉孔扇贝排放配子，借助显微镜观察精卵形态和活力，500目筛绢富集栉孔扇贝的形态圆润、卵黄均匀饱满的卵子，并收集足量的游动能力良好的精子；B.使用极距4mm的电转杯进行电穿孔，每个电转杯内加入电转缓冲液(50ml 2
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【专利技术属性】
技术研发人员：秦贞奎，李茜茜，张志峰，林思宇，陈越，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：