一种复制型高效引导编辑系统技术方案

本发明专利技术公开了一种复制型高效引导编辑编辑系统。本发明专利技术提供了一种用于基因编辑的载体，其能够表达由Cas9切刻酶或其变体和反转录酶或其变体融合而成的融合蛋白和EBNA1蛋白或其突变体EBNA1

【技术实现步骤摘要】
一种复制型高效引导编辑系统


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种复制型高效引导编辑(PE2)系统。

技术介绍

[0002]基因编辑技术是近年来发展起来的新兴技术，其能直接对生物基因组DNA进行编辑，目前已广泛应用生命科学的各个领域，具有广阔的发展前景。随着技术的发展与实际应用的需求，人们对基因编辑技术的精准性、效率与安全性要求愈来愈高，如大部分基因治疗研究中，必须使用更精准、更高效、更安全的基因编辑系统才能实现，然而现有的基因编辑技术很难同时满足上述需求。
[0003]目前开发的精确编辑系统主要包括CRISPR系统介导的基因敲入技术、单碱基编辑技术与引导编辑系统。以上几种方法均具有许多不足，如CRISPR介导的基因敲入技术，其虽然能够实现DNA的精确编辑，但是编辑效率较低且无法应用于原代细胞中。此外，由于该技术是基于DNA双链断裂的修复系统，所以会产生大量的非目标突变，进而引起安全风险；单碱基编辑技术是美国David Liu课题组开发的一种基于CRISPR系统的碱基编辑工具，该种技术可在不造成DNA双链断裂的情况下实现碱基编辑，但是该方法可改变的碱基种类有限，编辑窗口较大，无法实现特定碱基的精确突变，此外由于受到sgRNA设计所需PAM序列的限制，大部分位点不能被该方法编辑；Prime editing基因编辑系统同样是David Liu课题组开发的一种新型编辑系统，该系统通过将Cas9切刻酶与逆转录酶融合表达，在prime editing guide RNA(pegRNA)的引导下最终实现靶位点的精确编辑。该技术可实现包括12种碱基替换、小片段插入和缺失等的不同编辑类型，然而目前研究显示，其仍然具有效率较低等缺点。
[0004]但鉴于PE编辑系统的巨大潜力，科学家尝试采用多种方法改进PE编辑系统的效率，主要方法包括：PE1利用Cas9切刻酶(H840A)和Moloney Murine Leukemia Virus(M
‑
MLV)逆转录酶构成，虽可以精确实现设计的基因组编辑，但在哺乳动物细胞上的编辑效率较低。因此，研究人员构建了PE2，主要是通过在M
‑
MLV逆转录酶中引入5个氨基酸改变进而提高靶向位点的编辑效率。然而研究显示，这两种方法提高效率仍然有限；随后研究人员构建了PE3/PE3b，该系统通过共表达新的sgRNA靶向非编辑链进而提高编辑效率。相较PE2系统，PE3虽然具有较高的效率，但是其需要额外转入1条sgRNA，会增加表达载体的递送难度.此外，PE3系统会形成更多的非目标突变进而为未来的应用带来安全风险。综上可见，目前基因编辑领域仍然缺乏一种同时兼备效率高、非目标突变少，精准性强的基因编辑系统。
[0005]此前研究表明，人类疱疹病毒(EBV)可以在宿主细胞中以附加体的形式存在，这种在细胞的维持主要依赖EBNA1蛋白和OriP组合与DNA形成的加合物。因此，当把EBNA1
‑
OriP元件用于载体构建后，所构建载体可以在细胞中以游离体的形式稳定存在，并随着细胞周期进行复制，这显著增加了外源基因的表达时间和强度。
[0006]目前尚未有将附加体元件用于引导编辑系统表达的相关报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种附加体元件介导的复制型高效引导编辑(PE2)系统。
[0008]第一方面，本专利技术要求保护一种用于基因编辑的载体。
[0009]本专利技术所要求保护的用于基因编辑的载体，为附加体引导编辑系统载体，所述载体能够表达如下(A1)和(A2)，并含有如下(A3)和(A4)；
[0010](A1)由a1)和a2)融合而成的融合蛋白；a1)Cas9切刻酶或其变体；a2)反转录酶或其变体；
[0011](A2)EBNA1蛋白或其突变体EBNA1
Mut
；
[0012](A3)Orip元件；
[0013](A4)用于插入pegRNA编码序列的区域；所述用于插入pegRNA编码序列的区域含有插入位点和位于所述插入位点上游的启动子。所述启动子启动所述pegRNA编码序列的转录。
[0014]所述载体可为环形载体。
[0015]在(A1)中，所述Cas9切刻酶可为Cas9(H840A)。所述反转录酶可为M
‑
MLV RT(D200N,T306K,W313F,T330P,L603W)。
[0016]进一步地，所述Cas9(H840A)的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1
‑
1367位所示。所述M
‑
MLV RT(D200N,T306K,W313F,T330P,L603W)的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1401
‑
2091位所示。
[0017]在(A1)中，在所述融合蛋白中，a1)和a2)之间可由linker连接。
[0018]进一步地，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1368
‑
1400位所示。
[0019]在(A1)中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0020]在(A2)中，所述EBNA1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述EBNA1
Mut
蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0021]在(A4)中，所述用于插入pegRNA编码基因的区域中的所述启动子为Ⅱ型启动子或Ⅲ型启动子。
[0022]进一步地，所述Ⅲ型启动子如U6启动子；所述Ⅱ型启动子如EF1α启动子。
[0023]在本专利技术的具体实施方式中，所述U6启动子的序列如SEQ ID No.3的第14634
‑
14874位所示。
[0024]在(A4)中，所述pegRNA与sgRNA相比，在3
’
端多出两段序列(即RT序列和PBS序列)，依次由间隔序列(spacer)、gRNA骨架序列、RT序列和PBS序列组成。所述间隔序列(spacer)用于识别靶基因上的靶点。所述RT序列为基因组上靶点后的一段反向互补序列，且在其中引入目标突变，作为反转录酶的反转录模板，反转录出DNA序列，然后作为修复模板，对基因组DNA进行修复。所述PBS序列为引物结合位点，可与断裂的靶DNA链3
’
末端互补以起始逆转录过程。所述RT序列和所述PBS序列的设计方法或原理可参照现有技术中已报道的有关于引导编辑技术(Prime editing,PE)中与pegRNA的RT序列和PBS序列相关的设计方法或原理。
[0025]在(A1)中，所述Cas9(H840A)的编码基因可如SEQ ID No.3的第715
‑
4815位所示。所述M
‑
MLV RT(D200N,T306K,W313F,T330P,L603W)的编码基因可如SEQ ID No.3的第4915
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于基因编辑的载体，其特征在于：所述载体能够表达如下(A1)和(A2)，并含有如下(A3)和(A4)；(A1)由a1)和a2)融合而成的融合蛋白；a1)Cas9切刻酶或其变体；a2)反转录酶或其变体；(A2)EBNA1蛋白或其突变体EBNA1
Mut
；(A3)Orip元件；(A4)用于插入pegRNA编码序列的区域；所述用于插入pegRNA编码序列的区域含有插入位点和位于所述插入位点上游的启动子。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述Cas9切刻酶为Cas9(H840A)；进一步地，所述Cas9(H840A)的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1
‑
1367位所示；和/或所述反转录酶为M
‑
MLV RT(D200N,T306K,W313F,T330P,L603W)；进一步地，所述M
‑
MLV RT(D200N,T306K,W313F,T330P,L603W)的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1401
‑
2091位所示；和/或在所述融合蛋白中，a1)和a2)之间由linker连接；进一步地，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1368
‑
1400位所示；和/或所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；和/或所述EBNA1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述EBNA1
Mut
蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；和/或所述用于插入pegRNA编码基因的区域中的所述启动子为Ⅱ型启动子或Ⅲ型启动子；进一步地，所述Ⅲ型启动子为U6启动子；所述Ⅱ型启动子为EF1α启动子。3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述Cas9(H840A)的编码基因如SEQ ID No.3的第715
‑
4815位所示；和/或所述M
‑
MLV RT(D200N,T306K,W313F,T330P,L603W)的编码基因如SEQ ID No.3的第4915
‑
6987位所示；和/或所述融合蛋白的编码基因如SEQ ID No.3的第715
‑
6987位所示；和/或所述EBNA1蛋白的编码基因如SEQ ID No....

【专利技术属性】
技术研发人员：阮进学，赵书红，韩晓松，李新云，赵广兴，熊友才，苏寅钰，谢胜松，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：