用于研究GNE肌病的动物模型的方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及用于研究GNE肌病的动物模型的方法和应用。本发明专利技术的优点在于：1)相较于之前随机转基因(Tg)技术，本发明专利技术直接通过查询GNE基因转录版本，通过体外转录的方式，获得PiggyBACmRNA，后者倾向于将目的片段插入到转录活跃的区域，所以将大大提高获得阳性表达的转基因小鼠的几率。2)相较于之前ES细胞打靶技术，采用CRISPR/Cas9技术，通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和gRNA，利用非同源重组修复引入突变的方式，造成Gne基因蛋白读码框移码，功能缺失，可以避免质粒筛选失败、耗时长的缺点。耗时长的缺点。

【技术实现步骤摘要】
用于研究GNE肌病的动物模型的方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及用于研究GNE肌病的动物模型的方法和应用。

技术介绍

[0002]Gne基因编码UDP
‑
N
‑
乙酰葡糖胺
‑2‑
表位酶/N
‑
乙酰甘露糖胺激酶，具有多种功能，如唾液酸合成、细胞凋亡、细胞增殖等，可以表达在肾脏、大脑、心、脾脏、骨骼肌等，参与GNE肌病发生。
[0003]GNE肌病为常染色体隐性遗传性肌肉病，表现为胫骨前肌无力，可以累及多个系统，骨骼肌病理表现为异常Aβ沉积导致镶边空泡形成、能量代谢障碍出现萎缩肌纤维，但病理分子机制目前不清楚。
[0004]动物敲除Gne基因，会出现致死性胚胎，日本国立神经精神研究院是取得GNE患者外周血中DNA，进行测序，通过质粒转染进入小鼠受精卵，培育小鼠获得TgTn(hGNED176V)模型，关于GNE基因敲除模型，是来自于美国另一家实验室，通过查阅小鼠GNE基因组文库，克隆出含有外显子3的DNA片段，获得目的质粒并将其转入电穿孔后的受精卵，经抗生素筛选后获得GNE(+/
‑
)模型。
[0005]关于TgTn(hGNED176V)模型的缺点是，耗时长，转染效率低，不够稳定遗传，而且不能很好地反应疾病模型。本专利技术旨在寻找一种减少差异性，提高转染效率且能够稳定遗传的方法。
[0006]关于GNE(+/
‑
)模型的缺点是，耗时长，质粒易筛选失败，本专利技术旨在寻找一种可以避免质粒筛选失败、耗时长的方法，可以高效稳定选择性剪切GNE基因目的片段的方法。
[0007]GNE基因是保守基因，Gne基因敲除后动物会出现致死性胚胎，为研究GNE肌病发病机制，有待于通过目前基因技术制备一种既能存活又能稳定传代的动物模型。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术提供了用于研究GNE肌病的动物模型的方法和应用。
[0009]本专利技术提供了用于研究GNE肌病的动物模型的方法和应用。本专利技术的优点在于：1)相较于之前随机转基因(Tg)技术，本专利技术直接通过查询GNE基因转录版本，通过体外转录的方式，获得PiggyBAC mRNA，后者倾向于将目的片段插入到转录活跃的区域，所以将大大提高获得阳性表达的转基因小鼠的几率。2)相较于之前ES细胞打靶技术，采用CRISPR/Cas9技术，通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA，利用非同源重组修复引入突变的方式，造成Gne基因蛋白读码框移码，功能缺失，可以避免质粒筛选失败、耗时长的缺点。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]本专利技术提供了GNE肌病的动物模型的构建方法，包括如下步骤：
[0012]步骤1：将GNE基因与PiggyBAC质粒连接的重组质粒转入受精卵中，PCR鉴定，获得GNE基因过表达转基因动物；
[0013]步骤2：利用Cas9 mRNA和gRNA敲除GNE基因，PCR鉴定，获得F0代敲除GNE基因动物；
[0014]步骤3：将所述F0代敲除GNE基因动物与野生型动物交配，获得杂合敲除GNE基因动物；
[0015]步骤4：将所述杂合敲除GNE基因动物自交，PCR鉴定，获得纯合敲除GNE基因动物；
[0016]步骤5：将所述GNE基因过表达转基因动物与所述纯合敲除GNE基因动物杂交，获得GNE肌病的动物模型。
[0017]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述gRNA包括gRNA1和gRNA2；
[0018]所述gRNA1具有：
[0019](Ⅰ)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
[0020](Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0021](Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；
[0022]所述gRNA2具有：
[0023](Ⅰ)、如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
[0024](Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0025](Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
[0026]在本专利技术的一些具体实施方案中，获得杂合敲除GNE基因动物的步骤包括：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；将所述Cas9 mRNA和gRNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得8只阳性F1代小鼠。
[0027]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述敲除的exon包括exon 3。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1所述PCR鉴定的引物组包括：
[0029](Ⅰ)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
[0030](Ⅱ)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
[0031](Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
[0032](Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0033](
Ⅴ
)、与(Ⅰ)～(Ⅳ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。
[0034]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1所述PCR鉴定程序包括：
[0035][0036][0037]在本专利技术的一些具体实施方案中，获得GNE基因过表达转基因动物步骤包括：将所述重组质粒注射到小鼠的受精卵中，注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的
小鼠为首建鼠(F0代小鼠)。
[0038]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组扩增的片段为633bp。
[0039]在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2所述PCR鉴定的引物组包括：
[0040](Ⅰ)、上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
[0041](Ⅱ)、下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或
[0042](Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
[0043](Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.GNE肌病的动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将GNE基因与PiggyBAC质粒连接的重组质粒转入受精卵中，PCR鉴定，获得GNE基因过表达转基因动物；步骤2：利用Cas9 mRNA和gRNA敲除GNE基因，PCR鉴定，获得F0代敲除GNE基因动物；步骤3：将所述F0代敲除GNE基因动物与野生型动物交配，获得杂合敲除GNE基因动物；步骤4：将所述杂合敲除GNE基因动物自交，PCR鉴定，获得纯合敲除GNE基因动物；步骤5：将所述GNE基因过表达转基因动物与所述纯合敲除GNE基因动物杂交，获得GNE肌病的动物模型。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA包括gRNA1和gRNA2；所述gRNA1具有：(Ⅰ)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列；所述gRNA2具有：(Ⅰ)、如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述敲除的exon包括exon 3。4.如权利要求1至3任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤1所述PCR鉴定的引物组包括：(Ⅰ)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和(Ⅱ)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(
Ⅴ
)、与(Ⅰ)～(Ⅳ)任一项所述核苷酸序列具有至少80％序列同源性的核苷酸序列。5.如权利要求1至4任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤1所述PCR鉴定程序包括：Step#Temp(℃)TimeNote1982min
‑
29815sec
‑
35815sec
‑
4681minrepeatsteps2～4for34cycles5685min
‑
612
‑
Hold。6.如权利要求1至5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤2所述PCR鉴定的引物组
包括：(Ⅰ)、上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和(Ⅱ)、下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或(Ⅳ)、与(Ⅰ)～(Ⅲ)任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗晶，尚任，隋宪鸿，张彤彤，
申请(专利权)人：吉林大学第一医院，
类型：发明
国别省市：