一种基于探针法质粒捕获技术的DNA片段功能性互作组学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种质粒探针系统，所述系统可在体内进行功能状态下特定DNA片段相互作用组学分析，通过探针法捕获质粒获得完整、真实的原位互作组，通过与对照组比较分析进行特定DNA序列相互作用组学分析，从而提高实验灵敏度、特异度与可重复性。特异度与可重复性。特异度与可重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于探针法质粒捕获技术的DNA片段功能性互作组学分析方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于探针法质粒捕获技术的DNA片段功能性互作组学分析方法。

技术介绍

[0002]在DNA
‑
蛋白质相互作用的研究中，主流方法为DNA pull down及reverse
‑
ChIP技术。
[0003]DNApull down技术是使用特定序列的标记DNA探针在体外与蛋白样本共孵后得到与特定DNA序列结合的蛋白质。DNA探针与蛋白质结合的平衡主要受到蛋白、DNA探针浓度影响。考虑细胞内亚细胞区室及相分离等因素，细胞及亚细胞区室内蛋白浓度在功能状态下分布并不均一。目前，蛋白质提取方法仅能粗略区分到部分亚细胞结构，如线粒体、细胞核。因此，体外进行的DNApull down实验无法完整反应功能状态下细胞内蛋白质浓度分布情况。真核细胞内，表观修饰、转录复杂等生物过程调控通常以复杂的核酸
‑
蛋白复合体作为基本单位实现。非编码RNA往往也在蛋白复合体定位及装配过程中发挥重要作用。而目前DNApull down的蛋白提取过程往往忽略RNA保护，并且相较于蛋白质，RNA降解及构象改变更易发生于提取过程中，这些更降低了实验的可靠性及可重复性。并且，DNApull down中DNA探针无法对蛋白复合体进行功能验证，即特定DNA序列探针所结合蛋白可能无功能，增加实验的假阳性可能，增加实验时间及资源损耗。
[0004]Reverse
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ChIP技术首先使用甲醛等交联剂固定细胞内蛋白
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核酸复合体后，使用特定核酸探针捕获片段化的蛋白
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DNA复合体。Reverse ChIP所得产物可以反应生理状态下的DNA
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核酸相互作用及复合体组成，但由于Reverse ChIP实验对象为基因组DNA，且为了不影响目标DNA片段与蛋白的结合，因此需要寻找目标DNA片段周围无蛋白结合、与目标DNA片段复合体无相互作用的特异性靶向序列，这使得核酸探针设计变得十分困难，随着片段化长度减小而增加。同时，由于DNA片段化过程的随机性，捕获片段纯度较低，假阳性可能随着片段化长度的增加而增加。并且，由于内部对照组设置，难以纠正上述假阳性结果。综上，Reverse ChIP虽可反应生理状态下的DNA
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蛋白相互作用，但适用范围较小，应用较为困难，且后续验证成本较高。
[0005]另外，既往对于质粒DNA的捕获技术，是通过全细胞DNA提取后使用质粒安全的脱氧核糖核酸酶(Plasmid
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free Dnase)分解基因组DNA。然而，如此捕获质粒DNA会是质粒上所结合的蛋白质、RNA信息，无法用于下游机制研究。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术建立了一种基于探针法质粒捕获技术在细胞内进行功能状态下特定DNA片段相互作用组学分析的实验方法。具体地，
[0007]本专利技术第一方面提供了用于目标DNA片段功能性互作组学分析的报告质粒，所述
质粒包含第一核酸片段，所述第一核酸片段包含目标DNA片段及任选地荧光素酶编码片段。
[0008]在某些实施方式中，所述第一核酸片段进一步包含编码自剪切肽元件；优选地，所述剪切肽选自P2A，T2A，E2A和F2A。
[0009]在某些实施方式中，所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶。
[0010]在某些实施方式中，第一核酸片段进一步包含目标DNA调控序列。
[0011]在某些实施方式中，所述目标DNA选自甲基化位点片段、羟甲基化位点片段、乙酰化位点片段等DNA表观修饰位点片段，优选地，所述甲基化位点片段包含SEQ ID NO：1所述的核酸序列。
[0012]在某些实施方式中，所述目标DNA调控序列为CpG甲基化调控序列。
[0013]在某些实施方式中，所述质粒进一步包含第二核酸片段；优选地，所述第二核酸片段包含内参表达盒；更优选地，所述内参为海参荧光素酶。
[0014]在某些实施方式中，所述质粒进一步包含质粒复制、筛选、转录和/或翻译相关的基础调控元件，所述基础表达元件包括复制起始位点、启动子、筛选标记。
[0015]本专利技术第二方面提供了根据本专利技术第一方面所述的报告质粒捕获的探针。
[0016]在某些实施方式中，所述探针为5
’
端带有生物标记的ssDNA探针。
[0017]在某些实施方式中，所述探针为5
’
端带有生物标记的SEQ ID NO:9所示的核酸。
[0018]本专利技术第三方面提供了基于探针法质粒捕获技术的DNA片段功能性互作组学分析系统，所述系统包括根据本专利技术第一方面所述的报告质粒和根据本专利技术第二方面所述的探针。
[0019]本专利技术第四方面提供了根据本专利技术第一方面所述的报告质粒和/或根据本专利技术第二方面所述的探针和/或本专利技术第三方面所述的分析系统在目标DNA片段功能性互作组学研究中的应用。
[0020]在某些实施方式中，所述应用包括质粒、探针转染，细胞裂解，磁珠捕获探针
‑
质粒复合体，DNA、蛋白提取纯化等步骤。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术提供的质粒探针系统可在体内进行功能状态下特定DNA片段相互作用组学分析，通过探针法捕获质粒获得完整、真实的原位互作组，通过与对照组比较分析进行特定DNA序列相互作用组学分析，从而提高实验灵敏度、特异度与可重复性。
附图说明
[0023]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
[0024]图1显示DNA甲基化报告质粒图谱。(A)DNA甲基化调控报告质粒图谱；(B)含CpG甲基化调控序列的报告质粒图谱。
[0025]图2显示DNA甲基化报告质粒功能验证结果。(A)实时定量甲基化特异性PCR结果；(B)双荧光素酶报告实验结果；Met组为无调控序列的CpG甲基化报告质粒组，Met
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mrbox为含调控序列质粒组。
[0026]图3显示探针法质粒捕获产物验证结果。(A)探针法质粒捕获产物质粒富集的qPCR验证结果(Plasmid Concentraion＝Plasmid/GAPDH)；(B)探针法质粒捕获产物质粒富集的
qPCR后1％琼脂糖凝胶电泳验证结果；Neg组无质粒组，Met组为无调控序列的CpG甲基化报告质粒组，mrbox为含调控序列质粒组。
[0027]图4显示探针法质粒捕获技术在互作蛋白组学分析上的应用。(A)探针法质粒捕获蛋白产物考马斯亮蓝染色结果；(B)关于探针法质粒捕获蛋白产物的互作谱定性蛋白质组分析所富集蛋白交集的韦恩图；蛋白上样量均根据磁珠捕获DNA单位浓度配平。根据质谱结果，β
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actin在各组质粒互作蛋白中含量相近，可作为内参。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于目标DNA片段功能性互作组学分析的报告质粒，其特征在于，所述质粒包含第一核酸片段，所述第一核酸片段包含目标DNA片段及任选地荧光素酶编码片段。2.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，所述第一核酸片段进一步包含编码自剪切肽元件；优选地，所述剪切肽选自P2A，T2A，E2A和F2A。3.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，所述荧光素酶为萤火虫荧光素酶。4.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，第一核酸片段进一步包含目标DNA调控序列。5.根据权利要求1
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4任一项所述的报告质粒，其特征在于，所述目标DNA包括甲基化位点片段、羟甲基化位点片段、乙酰化位点片段，优选地，所述甲基化位点片段包含SEQ ID NO：1所述的核酸序列。6.根据权利要求5所述的报告质粒，其特征在于，目标DNA调控序列为CpG甲基化调控序列。7.根据权利要求1所述的报告质粒，其特征在于，所述质粒进一步包含第二核酸片段；优选地，所述第二核酸片段包含内参表达盒；更优选地，所述内参为海参荧光素酶。8.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：过一凡，古杰，葛棣，刘荣花，张宏宇，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：