一种树枝状有机荧光染料生物探针及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种树枝状有机荧光染料生物探针，该生物探针结构包括在一个壳聚寡糖分子上连接１至１５个树枝状有机荧光染料分子，同时再与一个叶酸分子结合形成的探针。同时还提供一种树枝状有机荧光染料生物探针的制备方法。本发明专利技术的效果是该生物探针制备方法简单，对变异细胞具有较好的标记靶向性，为标记变异细胞进行构效关系研究提供方便。在标记过程中表现出明显的荧光加合效应，增加了生物探针和细胞的生物相容性，明显提高了光稳定性，增大了标记的灵敏度。该生物探针对检测物的毒性低，灵敏度高，使用量少。该生物探针具有光谱范围广、摩尔消光系数大、无荧光背景、两资产率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学及生物技术交叉领域，特别是一种树枝状有机荧光染 料生物探针及制备方法。
技术介绍
众所周知，癌症已成为威胁人类健康的第一杀手，如何有效地控制其 发生和发展已成为当务之急。多数学者认为，在肿瘤的防治中，肿瘤得到 二级预防，即早査、早诊、早治将是未来相当长时期实体瘤获得大幅度提 高疗效的方向。由于分子生物标记具有价廉、安全、准确等优点，在医学 早期诊断方面越来越受到人们的关注。目前该技术已在癌症和艾滋病的识 别方面有较好的应用。生物荧光探针在生物领域的相关检测方法和技术与传统的同位素检测 相比具有速度快、重复性好、用量少及无辐射等特点。目前用于细胞标记 的生物荧光颜料探针主要有吖啶、菲啶类、荧光素类，二氟烷硼类，二苯 乙烯类、萘酰亚胺类、菁染料类等。但除菁染料类外，其他染料自身都会 产生强的荧光背景干扰。作为生物荧光探针，如何在增大其灵敏度的同时 提高光稳定性，减少荧光猝灭，并使其具有很好的癌细胞靶向性，是生物 荧光染料探针修饰研究的关键问题。树枝状化合物是一种结构完整、高度枝化的大分子。其分子在结构上 具有高度的几何对称性、精确的分子结构、大量的官能团、分子内存在空 腔及分子链增长具有可控性等特点，广泛用于医学、催化、染料、生物材 料等领域。由于树枝状化合物的中心以及内部存在活性点，在这些活性点 上接上荧光染料探针分子，可制备出树枝状有机荧光染料探针，该探针有4特定的空间、立体结构，且具备良好的稳定性和荧光特性。树枝状化合物 具有大量的反应活性点，可以进行各种功能基转化，功能化位点不同，树 枝状化合物表现出的性质也有所不同，如外层功能化时，官能团直接键接 到树枝状化合物的表面，负载量大，局部浓度高，有时还表现出官能团之 间的协同效应。树枝状化合物官能团之间可实现相互隔离，表现出"高度 稀释效应"。在以上研究基础上，拟在多糖分子上组装不同级次的树枝状 化合物并用于修饰菁染料，研究染料-多糖化合物由线状改变为立体结构 后，将提高对探针分子荧光增强的贡献率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种树枝状有机荧光染料探针及其制备方法，有 利于提高探针的光稳定性，同时增加染料与细胞的生物相容性以及在于生物组织结合及成像时表现出荧光加合效应，使探针分子与DNA或细胞相互 作用的光学灵敏度得到显著提高。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是提供一种树枝状有机荧光染料生物探针，其特征是该生物探针结构包括在一个壳聚寡糖分子上连接1至15个树枝状有机荧光染料分子，同时再与一个叶酸分子结合形成的 探针。 本专利技术同时还提供一种树枝状有机荧光染料生物探针的制备方法。本专利技术的效果为1. 本专利技术生物探针制备方法简单，对变异细胞初步表示研究表明，该探 针具有较好的标记靶向性，为采用该类生物探针标记变异细胞进行构效关 系研究提供了一种方法。2. 对检测物的毒性低，灵敏度高，使用量少。由于一个壳聚寡糖分子上 可连接众多树枝状有机荧光染料分子，本专利技术探针在标记过程中表现出明 显的荧光加合效应，在提高其光稳定性的同时增大了其标记灵敏度，使用量减少。3. 树枝状化合物的应引入，使荧光染料分子之间的距离增大，从而减少荧光染料分子相互碰撞猝灭的几率，增强了光稳定，起到荧光加合效应， 同时，增加了生物探针和细胞的生物相容性。4. 具有光谱范围广、摩尔消光系数大、无荧光背景、两资产率高和灵敏 度高等特点。附图说明图1为本专利技术的探针的叶酸-壳聚寡糖-树枝状有机荧光染料结构简图； 图2为本专利技术的树枝状有机荧光染料-壳聚寡糖-叶酸探针化学结构式。 具体实施例方式下面结合附图以及实施例进一步对本专利技术的一种树枝状有机荧光染料 生物探针及其制备方法加以说明，但不局限于本专利技术。本专利技术的一种树枝状有机荧光染料生物探针是基于以壳聚寡糖分子作 为叶酸配体和树枝状染料分子之间的桥梁，增加了染料的细胞相容性、降 低了对生物标记物的毒性。且由于壳聚寡糖具有很好的化学活性，很容易 对其进行化学改性并修饰具有特定基团的荧光染料，和可根据特定的对象 选择合适的生物分子进行修饰，如修饰配体定位受体及修饰探针DNA检测 目标DNA等。树枝状化合的引入提高了生物探针的灵敏度、降低了探针标 记的使用量，同时也提高了探针分子的生物相容性。本专利技术的一种树枝状有机荧光染料生物探针，该生物探针结构包括在 一个壳聚寡糖分子上连接1至15个树枝状有机荧光染料分子，同时再与一 个叶酸分子结合形成的探针。所述树枝状有机荧光染料是由一个树枝状化合物(dendrimer)分子与 2 8个荧光染料连接而成。所述壳聚寡糖(chitosan)分子的分子量为195 6000，所述壳聚寡糖分子的分子量也可为为200 2000。本专利技术的树枝状有机荧光染料生物探针的制备方法包括有以下步骤1) 树枝状有机荧光染料的制备① 将摩尔比为1: 3的2，2-二甲氧基乙胺及丙烯酸甲酯，置于甲醇溶剂 中，搅拌均匀，在温度为35 50°C的条件下反应两天，用柱层析分离，得 到甲基酯化合物l;② 取摩尔比为1: 3的上述甲基酯化合物1及乙二胺溶于甲醇溶剂，置 于反应瓶中搅拌，氮气保护下，避光反应2 3天，用油泵抽滤除去过量的乙二胺，得到一代树枝状化合物2。产物直接用于下一步反应；③ 取摩尔比为1: 2的上述第一代树枝状化合物2及荧光染料，溶于甲 醇溶剂，在氮气保护下，避光反应2 3天，析出红色针状晶体；重复一次上述①、②步骤的化学反应，得到二代树枝状化合物；二代 树枝状化合物与荧光染料反应可得到二代树枝状有机荧光染料；2) 壳聚寡糖-树枝状有机荧光染料的制备① 取适量树枝状有机荧光染料固体溶于摩尔比为0.03: 1的三氟醋酸 和盐酸溶液中，室温搅拌，室温搅拌1天后，将搅拌的混合物旋蒸，干燥 彻底后，得到醛基树枝状有机荧光染料；② 将80 100mg聚氨基多糖溶于含有适量冰醋酸水溶液中，向其中加入 上述2)中①步骤制得的醛基树枝状有机荧光染料，得到混合物；向该混合 物中加入25 30mL甲醇进行稀释，并室温搅拌充分后，加入100 120 mg 氰基硼氢化钠，并继续搅拌l天；③ 经上述②步骤反应后的混合液用100 150mL的饱和碳酸氢钠溶液和 丙酮处理，得到沉淀后的沉淀物通过过滤收集，将收集到的沉淀物分散在 5 10mL的lmol/L的氢氧化钾水溶液中，渗析2 3天，在_8 -15。C温度 下冻干，得到壳聚寡糖-树枝状有机荧光染料；3)叶酸-壳聚寡糖-树枝状有机荧光染料探针的制备7将上述2)制备的壳聚寡糖-树枝状有机荧光染料的干品与叶酸按摩尔比为1: 1溶解于二甲基亚砜溶液中，于室温下搅拌反应10小时后加入乙醚，产生沉淀物，经过滤所得到的沉淀物用乙醚洗涤后于25 35。C下真空 干燥，即得叶酸-可壳寡糖-树枝状化荧光染料探针干品。 所述荧光染料的简式为TO-C00H， CY3-C00H。实施例1:叶酸-壳聚寡糖-树枝状有机荧光染料生物探针I号的制备。1.制备树枝状有机荧光染料 (1)将3g (28.6腿o1) 2，2-二甲氧基乙胺及30ml甲醇置于50ml圆底 烧瓶，搅拌均匀，加入9.8g丙烯酸甲酯，在温度为50。C的条件下反应48h， 停止反应，用减压旋蒸仪除去溶剂，残留物进行柱层析分离，得到甲基酯 化合物1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种树枝状有机荧光染料生物探针，其特征是：该生物探针结构包括在一个壳聚寡糖分子上连接１至１５个树枝状有机荧光染料分子，同时再与一个叶酸分子结合形成的探针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：费学宁，兰云泉，张宝莲，谷迎春，
申请(专利权)人：天津城市建设学院，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]