一种用于启动子活性检测的慢病毒载体制造技术

本发明专利技术公开了一种用于启动子活性检测的慢病毒载体。本发明专利技术提供了慢病毒载体，其依次包括pCDH载体骨架A、多克隆位点、报告基因A、报告基因B、驱动筛选标记基因表达的启动子和pCDH载体骨架B；所述pCDH载体骨架B包括所述筛选标记基因，且该筛选标记基因位于所述驱动筛选标记基因表达的启动子下游。本发明专利技术制备载体具有多个多克隆位点用于待测基因的插入，使用第三代慢病毒载体骨架，更安全，包装出的假病毒可实现一些难转染细胞的稳定转染更真实的反应启动子活性，具有较低的背景，具有NLuc和CoGFP双重标记，有利于启动子活性的检测和评价。价。

【技术实现步骤摘要】
一种用于启动子活性检测的慢病毒载体


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于启动子活性检测的慢病毒载体。

技术介绍

[0002]荧光报告基因系统是研究启动子活性的重要方法，将目标启动子序列克隆至带有报告基因的载体上，目前研究中多使用瞬时转染的方法将启动子
‑
报告基因载体，连同对照载体共转染至细胞中，给予刺激后检测报告基因的表达情况，以此来评价启动子活性。但是由于转染过程的不均一性，往往需要共同转染一个其他报告基因的载体作为对照，来评价转染的效率。在这个过程中需要检测两种报告基因，增加了检测成本和系统的不稳定性。并且对于一些难转染细胞，例如免疫细胞，转染效率比较低，不适合这种方法。因此开发一种可用于稳定转染的报告基因系统，可显著提高检测效率和数据的真实性。
[0003]慢病毒载体系统是常用于外源基因稳定表达的方法，对于难转染细胞借助于抗性基因的筛选，也可获得稳定转染的细胞。以HIV为代表的慢病毒基因组包括9个基因所构成，gag、pol、env表达病毒的结构蛋白，tat、rev调节基因表达，vif、vpr、vpu、nef为辅助基因。在9个基因的共同作用下可表达出具有感染和复制活性的慢病毒。
[0004]在科学研究中，为了避免产生具有复制活性的慢病毒，开发了具有感染活性的假病毒，将病毒骨架与结构蛋白和调节基因分别在不同的载体上表达。经过了三代的发展，已经开发出具有安全高效的慢病毒系统。在第一代中由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成：用疱疹病毒糖蛋白G替换包膜蛋白单独在质粒中进行表达，包装载体表达gag/pol以及各种辅助蛋白，带有目的基因的穿梭载体带有包装信号ψ及LTRs，可将目的基因包装在假病毒中；第二代中慢病毒载体中去除了辅助基因，在不影响病毒的滴度和转染能力的情况下，增加了载体的安全性；第三代载体中删除了5
’‑
LTR的U3和3
’‑
LTR的U3,去除了tat基因，使用CMV启动子以起始病毒基因组RNA的转录，同时只保留了3个(gag、pol和rev)基因，因此第三代慢病毒载体系统更加安全。
[0005]由于第三代慢病毒载体中删除3
’‑
LTR的U3区域，使用异源启动子融合的嵌合5'
‑
LTR，使得整合到基因组中的序列无法独立进行RNA的转录，因此更加安全。报告基因转录需要依靠待检测的目标启动子的驱动，更加真实的反应目标启动子的活性，降低报告基因的背景信号。
[0006]目前通常使用瞬时转染的方法来检测启动子的活性，然而对于一些难转染细胞比较困难，并且市场上在售的基于慢病毒系统的启动子活性检测载体多使用第二代慢病毒系统，背景很高。因此，需要寻找一种新的检测启动子活性的慢病毒载体。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种用于启动子活性检测的慢病毒载体。
[0008]第一方面，本专利技术提供了慢病毒载体，其依次包括pCDH载体骨架A、多克隆位点、报告基因A、报告基因B、驱动筛选标记基因表达的启动子和pCDH载体骨架B；
[0009]所述pCDH载体骨架B包括所述筛选标记基因，且该筛选标记基因位于所述驱动筛选标记基因表达的启动子下游；
[0010]所述pCDH载体骨架A为序列1第1
‑
1933位；
[0011]所述pCDH载体骨架B为序列1第3866
‑
8370位。
[0012]上文所述慢病毒载体中，
[0013]所述多克隆位点包括BstBI酶切识别位点、EcoRI酶切识别位点、SalI酶切识别位点、XmaI酶切识别位点、SmaI酶切识别位点和BamHI酶切识别位点；
[0014]所述报告基因A和所述报告基因B不同。
[0015]在本专利技术的实施例中，所述报告基因A具体为NLuc基因(序列1第1986
‑
2498位)；
[0016]所述报告基因B具体为CopGFP基因(序列1第2595
‑
3257位)；
[0017]所述筛选标记基因为Puro基因(序列1第3866
‑
4465位)；
[0018]所述驱动筛选标记基因表达的启动子为PGK(序列1第3337
‑
3845位)。
[0019]上文所述慢病毒载体的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0020]第二方面，本专利技术提供了一种制备第一方面所述的慢病毒载体的方法，包括如下步骤：
[0021]1)制备目标片段和第三代慢病毒载体骨架；
[0022]所述目标片段包括第一方面中所述多克隆位点、所述报告基因A、所述报告基因B和所述驱动筛选标记基因表达的启动子；
[0023]所述第三代慢病毒载体骨架由序列1中第1
‑
1933所示载体骨架A和序列1第3866
‑
8370位所示载体骨架B组成；其中序列1第3866
‑
4465位为筛选标记基因；
[0024]2)将所述目标片段和所述第三代慢病毒载体骨架连接，得到慢病毒载体。
[0025]具体为将所述目标片段连接到所述第三代慢病毒载体的两部分载体骨架之间，得到慢病毒载体，且所述目标片段中的驱动筛选标记基因表达的启动子驱动位于其下游的筛选标记基因的表达。
[0026]上文所述方法中，所述目标片段的核苷酸序列为序列1第1934
‑
3865位。
[0027]上文所述方法中，在本专利技术的实施例中，
[0028]目标片段(MCS
‑
NLuc
‑
P2A
‑
CopGFP
‑
PGK片段)按照如下方法制备：以MCS
‑
F、PGK
‑
R为引物，用pLVX
‑
MCS
‑
NLuc
‑
P2A
‑
CopGFP
‑
PGK
‑
Puro为模板来扩增，得到MCS
‑
NLuc
‑
P2A
‑
CopGFP
‑
PGK片段。
[0029]上述pLVX
‑
MCS
‑
NLuc
‑
P2A
‑
CopGFP
‑
PGK
‑
Puro按照如下方法制备：先用PGK
‑
F、pLVX
‑
R为引物，以pLVX
‑
MetLuc为模板，扩增pLVX
‑
MCS
‑
PGK
‑
Puro载体骨架；使用NLuc
‑
F、GFP
‑
R为引物，以pCDH
‑
CMV
‑
NLuc
‑
P2A...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.慢病毒载体，其依次包括pCDH载体骨架A、多克隆位点、报告基因A、报告基因B、驱动筛选标记基因表达的启动子和pCDH载体骨架B；所述pCDH载体骨架B包括所述筛选标记基因，且该筛选标记基因位于所述驱动筛选标记基因表达的启动子下游；所述pCDH载体骨架A为序列1第1
‑
1933位；所述pCDH载体骨架B为序列1第3866
‑
8370位。2.根据权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于：所述多克隆位点包括BstBI酶切识别位点、EcoRI酶切识别位点、SalI酶切识别位点、XmaI酶切识别位点、SmaI酶切识别位点和BamHI酶切识别位点；所述报告基因A和所述报告基因B不同。3.根据权利要求1或2所述的慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体的核苷酸序列为序列表中序列1。4.一种制备权利要求1
‑
3中任一所述的慢病毒载体的方法，包括如下步骤：1)制备目标片段和第三代慢病毒载体骨架；所述目标片段包括权利要求1
‑
3中所述多克隆位点、所述报告基因A、所述报告基因B和所述驱动筛选标记基因表达的启动子；所述第三代慢病毒载体骨架由序列1中第1
‑
1933所示载体骨架A和序列1第3866
‑
8370位所示载体骨架B组成；其中序列1第3866
‑
4465位为筛选标记基因；2)将所述目标片段和所述第三...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔德聪，黄文华，江华，刘鹏，律清宇，姜永强，李倩，李旭东，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：