共表达CXCR4和IL-10的间充质干细胞及其用途制造技术

本发明专利技术涉及间充质干细胞(MSC)，其特征在于所述间充质干细胞用整合表达载体转导以稳定地共表达趋化因子受体4型CXCR4和白介素IL

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】共表达CXCR4和IL
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10的间充质干细胞及其用途


[0001]本专利技术涉及医学领域。特别地，本专利技术涉及间充质干细胞(MSC)，其特征在于所述间充质干细胞用整合表达载体转导，以稳定地共表达趋化因子受体4型CXCR4和白介素IL
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10。本专利技术还涉及所述MSC用作药物的用途，特别是用于治疗炎症性疾病和/或自身免疫性疾病。

技术介绍

[0002]MSC是对活化的淋巴样细胞(包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和树突细胞)具有免疫调节作用的多能成体基质细胞。MSC展示在发炎部位归巢的能力，在发炎部位它们可以调节炎症性反应并有助于修复受损组织。
[0003]在动物模型中，已经在再生医学以及炎症性疾病模型和自身免疫性疾病模型中证明MSC的效力。在I/II期临床试验中，已证明MSC的安全特性，并且已显示对不同疾病(如，类固醇抗性移植物抗宿主病(GVHD)、严重系统性红斑狼疮、复杂肛周瘘、膝骨关节炎或慢性完全性截瘫等)的临床益处的初步证据。尽管在动物模型和早期临床试验中获得了结果，但仅在三种III期临床试验中，MSC的治疗效力相比标准疗法显示统计学显著性。这些临床试验包括治疗复杂肛周瘘(NCT00475410)，儿童类固醇难治性GVHD(NCT02336230)和慢性晚期缺血性心力衰竭(NCT01768702)。
[0004]在可能降低MSC治疗效力的参数中，值得一提的是，这些细胞的离体扩增已显示降低在MSC中观测到的归巢受体的适度表达，并且还诱导这些细胞的衰老。
>[0005]因此，本专利技术集中于改善MSC的治疗效力，特别是通过改善MSC向发炎部位的迁移，以及通过分泌免疫抑制细胞因子和抗炎细胞因子，从而增强标准未修饰MSC的治疗效力。

技术实现思路

[0006]专利技术简述
[0007]如上所述，本专利技术集中于相比于标准未修饰MSC，改善MSC的治疗效力，特别是通过增强MSC向发炎部位的迁移并且通过增强免疫抑制细胞因子和抗炎细胞因子的释放。
[0008]为此，本专利技术的专利技术人使用了用共表达趋化因子受体4型CXCR4和白介素IL
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10的整合表达载体转导的MSC。
[0009]特别地，在本专利技术的背景下构建了编码CXCR4和IL
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10的慢病毒载体。该表达载体用于转导MSC，从而以稳定的方式共表达CXCR4和IL
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10。
[0010]实施例2.1显示，用CXCR4
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IL10 mRNA转染的MSC在局部炎症的小鼠模型中产生抗炎特性。然而，与WT MSC相比，这些细胞未显示增强的抗移植物抗宿主病(GvHD)特性(实施例2.2)。与用CXCR4
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IL10 mRNA转染的MSC相反，相比于WT MSC，用携带CXCR4
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IL10序列的慢病毒载体转导的MSC(实施例2.3)，不仅产生增强的体外免疫调节特性(实施例2.4和2.5)和体内局部抗炎作用(实施例2.3至2.6)，而且还明显地形成了显著的抗GvHD作用，如本专利技术的实施例2.7所示。
[0011]事实上，本专利技术包括的体外实验显示，这些分子的稳定共表达高效地增强MSC向SDF
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1的迁移并改善这些细胞的免疫抑制特性。此外，在诱导局部足垫炎症(pad inflammation)的小鼠模型中证明异位表达CXCR4和IL10的MSC优先归巢到发炎的足垫。总之，这些结果证明，与WT MSC相比，人MSC中的特异性归巢分子和抗炎分子(如CXCR4和IL10)的稳定共表达在这些细胞中赋予增强的抗炎潜力。这种用共表达CXCR4和IL10的整合表达载体转导的新一代MSC的使用，将对治疗炎症性疾病和/或自身免疫性疾病的临床细胞疗法具有显著的影响。
[0012]因此，总体而言，本文提出了用共表达CXCR4和IL
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10二者的整合表达载体转导的MSC用作药物的用途，特别是用于治疗炎症性疾病和/或自身免疫性疾病。
[0013]因此，本专利技术的第一实施方式涉及包含DNA序列的表达盒(以下称为本专利技术的表达盒)，所述DNA序列依次包含：a)启动子，b)编码趋化因子受体4型CXCR4的序列，和c)编码白介素IL
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10的序列。在优选实施方式中，表达盒还包含用于增加转基因表达的调控元件。在优选实施方式中，调控元件是土拨鼠肝炎病毒调控元件(WPRE)RNA输出信号序列或其功能变体或片段。在优选实施方式中，表达盒还包含位于编码趋化因子受体4型CXCR4的序列和编码白介素IL
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10的序列之间的编码自催化肽的序列。在优选实施方式中，自催化肽是E2A。在优选实施方式中，启动子是人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子序列或其功能同源物或变体。在优选实施方式中，表达盒按5
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至3
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的顺序包含：a)人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子序列或其功能同源物或变体，b)编码趋化因子受体4型CXCR4的序列，c)编码自催化肽E2A的序列，d)编码白介素IL
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10的序列；和d)土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
[0014]在优选实施方式中，表达盒包含人基因CXCR4(SEQ ID NO:1)和IL10(SEQ ID NO:3)的非天然密码子优化的序列。在优选实施方式中，编码自催化肽E2A的序列是SEQ ID NO:2，其用于使两种分子(CXCR4和IL10)易于共表达。
[0015]本专利技术的第二实施方式涉及包含上述定义的表达盒的重组基因递送载体(下文称为本专利技术的重组基因递送载体)。在优选实施方式中，重组基因递送载体是慢病毒载体。在优选实施方式中，本专利技术的载体是永久合并入宿主染色体的整合载体。
[0016]本专利技术的第三实施方式涉及包含本专利技术的表达盒或重组基因递送载体的细胞(下文称为本专利技术的细胞)。在优选实施方式中，细胞是源自骨髓、胎盘、脐带、羊膜、月经血、外周血、唾液腺、皮肤和包皮、滑液、羊水、子宫内膜、脂肪组织、脐带血和/或牙齿组织的MSC。
[0017]本专利技术的第四实施方式涉及药物组合物，其包含本专利技术的重组基因递送载体或细胞，以及任选地，药学上可接受的赋形剂或载体(carrier)。
[0018]本专利技术的第五实施方式涉及用作药物用途的本专利技术的基因递送载体或细胞。在优选实施方式中，本专利技术涉及用于治疗炎症性疾病和/或自身免疫性疾病(例如，移植物抗宿主病(GvHD)、败血症或类风湿性关节炎)的本专利技术的基因递送载体或细胞。或者，该实施方式涉及用于治疗炎症性疾病和/或自身免疫性疾病(例如，移植物抗宿主病(GvHD)、败血症或类风湿性关节炎)的方法，该方法包括向患者施用治疗有效剂量或量的本专利技术的基因递送载体或细胞，或包含本专利技术的基因递送载体或细胞的药物组合物。
[0019]为了本专利技术的目的，定义以下术语：
[0020]·“包含”意指包括但不限于词语“包含”之后的任何一个。因此，术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种DNA表达盒，包含：a.启动子；b.编码趋化因子受体4型CXCR4的序列；和c.编码白介素IL
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10的序列。2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述编码趋化因子受体4型CXCR4的序列为SEQ ID NO:1，并且所述编码白介素IL
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10的序列为SEQ ID NO:3。3.根据权利要求1或2任一项所述的表达盒，还包含用于增加转基因表达的调控元件。4.根据权利要求1至3中任一项所述的表达盒，其中所述调控元件为土拨鼠肝炎病毒调控元件(WPRE)RNA输出信号序列或其功能变体或片段。5.根据权利要求1至4中任一项所述的表达盒，还包含位于所述编码趋化因子受体4型CXCR4的序列和所述编码白介素IL
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10的序列之间的编码自催化肽的序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的表达盒，其中所述自催化肽为E2A，优选SEQ ID NO:2。7.根据权利要求1至6中任一项所述的表达盒，其中所述启动子为人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子序列或其功能同源物或变体。8.根据权利要求1至7中任一项所述的表达盒，按5
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至3
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的顺序包含：a.人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子序列或其功能同源物或变体；b.编码趋化因子受体4型CXCR4的序列；c.编码自催化肽E2A的序列；d.编码白介素IL
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10的序列；和e.土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的表达盒，按5
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至3
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗萨里奥，
申请(专利权)人：能源环境和技术研究中心OAMP生物医学网络研究财团中心，
类型：发明
国别省市：