PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体的说是PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法，该研究方法如下所示：S1：细胞培养和转染；S2：慢病毒和稳定细胞系的生成；S3：蛋白提取、蛋白质印迹；S4：蛋白半衰期实验；S5：免疫共沉淀和体外泛素化实验S6：提取RNA和PCR；S7：免疫荧光(IF)；本发明专利技术提供PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法，以证明PRMT7和SOX9在非小细胞肺癌癌症中的作用、PRMT7和SOX9的关系以及其调控机制，对NSCLC和其他病因依赖于PRMT7

【技术实现步骤摘要】
PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体的说是PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法。

技术介绍

[0002]癌症仍是世界上癌症死亡的主要原因，非小细胞肺癌(NSCLC)占癌症常见亚型的85％，尽管过去几十年见证了靶向治疗和化疗的进步，但NSCLC的发病率和死亡率仍然很高，而且仍在增加，因此，迫切需要阐明NSCLC发生和发展的分子机制。
[0003]SOX9属于结构相关的性别决定区Y(SRY)
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含有转录因子的盒(SOX)家族，该家族在人类发育过程中发挥多种功能；据报道，SOX9在包括NSCLC在内的多种癌症中过表达，并在肿瘤发展中发挥致癌作用，SOX9已被报道促进肺祖细胞增殖并抑制气道早熟分化，再生和恶性肺细胞都利用祖细胞基因调控网络，调节因子的作用具有潜在的治疗价值，SOX9的表达在转录、转录后和翻译后水平受到调节，而蛋白翻译后修饰主要包括磷酸化、甲基化、乙酰化、去乙酰化、SUMO化和泛素化，蛋白翻译后修饰在调节SOX9蛋白的稳定性方面发挥着重要作用。
[0004]蛋白精氨酸甲基转移酶7(PRMT7)是蛋白精氨酰甲基转移酶(PRMT)家族的9个成员之一，PRMT7参与许多细胞过程，包括转录调节、DNA损伤反应/DNA修复、RNA剪接、细胞分化和增殖以及转移能力；据报道，PRMT7在各种癌症如乳腺癌症、白血病和肾细胞癌中的高表达与肿瘤的发生、增殖和侵袭有关；PRMT7也被报道有助于人类非小细胞肺癌癌症细胞的转移表型，但其在非小细胞癌症中的功能和潜在机制尚不清楚，其与SOX9的调节关系尚未报道；在此，我们证明PRMT7和SOX9在非小细胞肺癌癌症中的作用、PRMT7和SOX9的关系以及其调控机制，对NSCLC和其他病因依赖于PRMT7
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SOX9失调的癌症的靶向治疗具有临床实用性；为此，本专利技术提供PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法。

技术实现思路

[0005]为了弥补现有技术的不足，证明PRMT7和SOX9在非小细胞肺癌癌症中的作用、PRMT7和SOX9的关系以及其调控机制，对NSCLC和其他病因依赖于PRMT7
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SOX9失调的癌症的靶向治疗具有临床实用性，本专利技术提出的PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术所述的PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法,该研究方法如下所示：
[0007]S1：细胞培养和转染；
[0008]S2：慢病毒和稳定细胞系的生成；
[0009]S3：蛋白提取、蛋白质印迹；
[0010]S4：蛋白半衰期实验；
[0011]S5：免疫共沉淀和体外泛素化实验
[0012]S6：提取RNA和PCR；
[0013]S7：免疫荧光(IF)。
[0014]优选的，所述S1中细胞培养和转染的具体方法如下所示：
[0015]A1:细胞培养：将HEK293T和H1299细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的培养基(DMEM)中，在37℃、5％CO2的无菌培养箱中培养，其细胞通过短串联重复测定进行鉴定，同时细胞在收到后立即进行扩增，然后冷冻，每3至4个月复苏一次，使用的所有细胞系每2周会对支原体污染进行常规监测；
[0016]A2：质粒转染：使用Neofect DNA转染试剂对细胞进行转染过程如下，细胞铺板：提前一天将细胞种植在六孔板中，以转染时细胞密度在60％
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80％为宜；在转染前2小时，更换新的完全培养基2ml；将2μg质粒(所有需转入的质粒共2ug)DNA用100μL无血清稀释液稀释，充分混匀后制成DNA稀释液；向DNA稀释液中直接加入2μL Neofect DNA转染试剂，轻柔混匀，室温静置15
‑
30分钟，转染复合物制备完成后将转染复合物加入细胞培养基中，轻柔混匀；继续培养24
‑
36小时，收获细胞进行蛋白质印迹法检测目的蛋白。
[0017]优选的，所述S2中慢病毒和稳定细胞系的生成的具体方法如下所示：
[0018]B1：慢病毒构建：运用CRISPR/Cas9进行PRMT7敲除和载体构建得到PRMT7
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sgRNA与对照病毒，不带荧光，嘌呤霉素抗性，其PRMT7 sgRNA靶序列如下：5'
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GTCGGGCCAATCCGACCACG
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3'；通过SOX9过表达慢病毒成品NM_000346LV
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SOX9，绿光，嘌呤霉素抗性；
[0019]B2：病毒感染：病毒感染前一天对H1299细胞进行六孔板铺板，密度为30％，在二氧化碳培养箱中过夜孵育；转病毒时先更换1ml完全培养基，然后每孔以MOI值为10转入PRMT7
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sgRNA慢病毒与对照病毒，并以每孔8μg/ml加入Polybrene，在二氧化碳培养箱继续孵育，在慢病毒感染18小时后换液；病毒转染72小时后观察荧光情况，随后更换新鲜完全培养基并加入嘌呤，嘌呤浓度1ug/ml，随后每24小时观察细胞状态细胞长满后进行胰酶消化留取一部分传代并继续用含嘌呤霉素的培养基进行筛选5
‑
7天，剩余进行提蛋白及RNA检测敲除效果；其得到PRMT7稳定敲除细胞系后，在此基础上构建过表达SOX9稳定细胞系，方法同上；构建完成后运用流式筛选表达绿光的细胞，并进行培养传代，同时得到对照组，PRMT7
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sgRNA和PRMT7
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sgRNA+SOX9三组稳定表达的H1299细胞系。
[0020]优选的，所述S3中蛋白提取和蛋白质印迹的具体方法如下所示：
[0021]C1：蛋白质提取：选用S1中的质粒转染细胞在3000rpm，离心1min，去上清，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液buffer 200ul，冰上裂解45min，每7
‑
8min震荡一次，每次10s左右；充分裂解后12000rpm，4℃离心5min，去细胞碎片，留取上清；加入67ul 4
×
loading buffer，振荡混匀，继续冰上裂解30min，每10min震荡一次，每次约10s左右，振荡完成后100℃干浴10min，
‑
80℃保存蛋白；
[0022]C2：蛋白质免疫印迹：制胶，根据分子量和配胶表配制浓度适宜的分离胶，加入双蒸水压胶，室温放置45分钟，待分离胶凝固后配制浓度为5％的浓缩胶，室温静止放置30分钟；样品上样，待浓缩胶凝固后，使用蛋白上样针按顺序加入maker以及按照顺序排列的蛋白样品；蛋白电泳，80V稳压电泳至分离胶，调节电压至120V，上样缓冲液达到底部边缘时停止电泳，电泳时间约为2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法，其特征在于，该研究方法如下所示：S1：细胞培养和转染；S2：慢病毒和稳定细胞系的生成；S3：蛋白提取、蛋白质印迹；S4：蛋白半衰期实验；S5：免疫共沉淀和体外泛素化实验S6：提取RNA和PCR；S7：免疫荧光(IF)。2.根据权利要求1所述的PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法，其特征在于，所述S1中细胞培养和转染的具体方法如下所示：A1:细胞培养：将HEK293T和H1299细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的培养基(DMEM)中，在37℃、5％CO2的无菌培养箱中培养，其细胞通过短串联重复测定进行鉴定，同时细胞在收到后立即进行扩增，然后冷冻，每3至4个月复苏一次，使用的所有细胞系每2周会对支原体污染进行常规监测；A2：质粒转染：使用Neofect DNA转染试剂对细胞进行转染过程如下，细胞铺板：提前一天将细胞种植在六孔板中，以转染时细胞密度在60％
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80％为宜；在转染前2小时，更换新的完全培养基2ml；将2μg质粒(所有需转入的质粒共2ug)DNA用100μL无血清稀释液稀释，充分混匀后制成DNA稀释液；向DNA稀释液中直接加入2μL Neofect DNA转染试剂，轻柔混匀，室温静置15
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30分钟，转染复合物制备完成后将转染复合物加入细胞培养基中，轻柔混匀；继续培养24
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36小时，收获细胞进行蛋白质印迹法检测目的蛋白。3.根据权利要求2所述的PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法，其特征在于，所述S2中慢病毒和稳定细胞系的生成的具体方法如下所示：B1：慢病毒构建：运用CRISPR/Cas9进行PRMT7敲除和载体构建得到PRMT7
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sgRNA与对照病毒，不带荧光，嘌呤霉素抗性，其PRMT7 sgRNA靶序列如下：5'
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GTCGGGCCAATCCGACCACG
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3'；通过SOX9过表达慢病毒成品NM_000346LV
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SOX9，绿光，嘌呤霉素抗性；B2：病毒感染：病毒感染前一天对H1299细胞进行六孔板铺板，密度为30％，在二氧化碳培养箱中过夜孵育；转病毒时先更换1ml完全培养基，然后每孔以MOI值为10转入PRMT7
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sgRNA慢病毒与对照病毒，并以每孔8μg/ml加入Polybrene，在二氧化碳培养箱继续孵育，在慢病毒感染18小时后换液；病毒转染72小时后观察荧光情况，随后更换新鲜完全培养基并加入嘌呤，嘌呤浓度1ug/ml，随后每24小时观察细胞状态细胞长满后进行胰酶消化留取一部分传代并继续用含嘌呤霉素的培养基进行筛选5
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7天，剩余进行提蛋白及RNA检测敲除效果；其得到PRMT7稳定敲除细胞系后，在此基础上构建过表达SOX9稳定细胞系，方法同上；构建完成后运用流式筛选表达绿光的细胞，并进行培养传代，同时得到对照组，PRMT7
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sgRNA和PRMT7
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sgRNA+SOX9三组稳定表达的H1299细胞系。4.根据权利要求3所述的PRMT7抑制SOX9泛素化修饰维持其蛋白稳态促进肺癌的研究方法，其特征在于，所述S3中蛋白提取和蛋白质印迹的具体方法如下所示：C1：蛋白质提取：选用S1中的质粒转染细胞在3000rpm，离心1min，去上清，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液buffer 200ul，冰上裂解45min，每7
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8min震荡一次，每次10s左右；充分
裂解后12000rpm，4℃离心5min，去细胞碎片，留取上清；加入67ul 4
×
loading buffer，振荡混匀，继续冰上裂解30min，每10min震荡一次，每次约10s左右，振荡完成后100℃干浴10min，
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80℃保存蛋白；C2：蛋白质免疫印迹：制胶，根据分子量和配胶表配制浓度适宜的分离胶，加入双蒸水压胶，室温放置45分钟，待分离胶凝固后配制浓度为5％的浓缩胶，室温静止放置30分钟；样品上样，待浓缩胶凝固后，使用蛋白上样针按顺序加入maker以及按照顺序排列的蛋白样品；蛋白电泳，80V稳压电泳至分离胶，调节电压至120V，上样缓冲液达到底部边缘时停止电泳，电泳时间约为2小时左右；转膜，首先准备好与凝胶形状大小相同的NC膜和滤纸片，将NC膜与滤纸浸入电转缓冲液中，根据电泳仪的极性，正确的将滤纸、凝胶、NC膜、滤纸的顺序夹好，注意凝胶上蛋白的转移方向为负极向正极移动，在电流的作用下使蛋白质从胶转移至NC膜上，电压为100V，在冰浴中进行电转2小时；封闭，将膜取出放在封闭液中于摇床上室温摇2小时；孵育一抗，用抗体稀释液分别稀释目的蛋白和内参抗体，4℃过夜孵育；洗膜，次日取出所孵育一抗的NC膜，TBST漂洗10分钟/次...

【专利技术属性】
技术研发人员：奉雅丽，刘春刚，任红，龙腾，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：