一种增殖速度提高的肺癌细胞模型的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种增殖速度提高的肺癌细胞模型的制备方法及其应用。本发明专利技术基于dCas9

【技术实现步骤摘要】
一种增殖速度提高的肺癌细胞模型的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种增殖速度提高的肺癌细胞模型的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是严重威胁人类生命安全的常见恶性肿瘤，其死亡率在全球仍居第一位。从组织学的角度，肺癌可以分为非小细胞肺癌(non
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small cell lungcancer，NSCLC)与小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)两种，其中约85％的肺癌患者病理类型为NSCLC，并且超过40％的NSCLC患者在确诊时的肿瘤分期己经是局部晚期或者晚期，错失了通过手术切除肿瘤的最佳时机。当前我国肺癌的总体治疗情况并不乐观，局部晚期NSCLC患者总体五年生存率低于15％，而晚期患者总体五年生存率仅为5％不到。
[0003]目前，对于肺癌发生发展机制的研究更为多元化，为NSCLC患者带来了新的希望。其中，dCas9介导的转录调控可作为在体内查询肿瘤表型的通用工具。利用靶向转录调控技术，靶向转录起始位点上游或下游的基因组区域，从而在体外动物模型或肿瘤细胞中进行特定且可持续的基因表达水平改变。
[0004]对Cas蛋白HNH和RuvC两个结构域中的D10A和H840A氨基酸进行点突变可以获得剪切失活的Cas9蛋白。由此产生的核酸酶缺陷型dCas9不能切割DNA，但在sgRNA的引导下仍能与DNA特异性结合。基于此，研究人员融合了不同的转录调控相关的因子，以dCas9
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sgRNA复合物作为一个支架，将一系列转录效应因子募集到目标位置来激活或者抑制目标基因转录表达，从而发挥调控调节基因表达的重要作用。
[0005]在大肠杆菌中，dCas9与序列特异性sgRNA配对，dCas9
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sgRNA复合物通过阻断RNA聚合酶(polymerase，Pol)或者破坏转录因子结合来阻止转录起始干扰转录延伸，称为CRISPR的干扰(CRISPR interference，CRISPRi)作用。然而将CRISPRi引入HEK293T细胞，发现dCas9的抑制效果有限。为了提高真核细胞中dCas9的转录抑制效果，研究人员开发了dCas9
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KRAB系统，将dCas9氨基末端与Kox1的转录阻遏物结构域KRAB(Kr
ü
ppel
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associated box)融合，依靠KRAB募集各种各样的组蛋白修饰因子，通过形成异染色质的方式可逆地抑制基因表达。
[0006]CRISPR
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dCas9调控基因表达的能力已被广泛应用于多个领域，包括干细胞分化、诱导细胞重编程、全基因组水平筛选、疾病机制研究、疾病模型构建、阐明基因功能研究、基因与基因的相互作用研究等方面。
[0007]2021年德国慕尼黑亥姆霍尔兹中心的研究人员利用CRISPR
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dCas9调控基因表达技术在人类胚胎干细胞中激活了一组特定的HERV
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K(HML
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2)，发现HERV
‑
K(HML
‑
2)的转录激活会高度激活参与大脑发育的NTRK3基因和其他神经退行性相关基因，证实了HERV激活对人类大脑发育的负面影响。武汉大学蒋卫课题组发现PAR bZIP家族成员TEF可以直接结合HERV
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K家族LTR5Hs亚型的MER57E3，并进一步利用CRISPR
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dCas9调控基因表达技术证明MER57E3在功能上可作为近端调控元件激活ZNF基因。Sakashita A等人设计靶向LTR10B的
sgRNA，利用CRISPR
‑
dCas9调控基因表达技术激活LTR10B调控的相邻基因，最终证明ERVs可作为增强子来驱动生殖系基因的表达，并揭示了这种调控显现的普遍性。

技术实现思路

[0008]本专利技术的一个目的是提供一种增殖速度提高的肺癌细胞的制备方法。
[0009]本专利技术提供的增殖速度提高的肺癌细胞的制备方法包括如下步骤：使肺癌细胞中表达dCas9
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KRAB融合蛋白、MS2
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P65
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HSF1融合蛋白、靶向LTR5Hs序列第83
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89位的sgRNA；所述LTR5Hs序列如序列1所示。其中，LTR5Hs序列第83
‑
89位为TP53结合位点，在本专利技术的一个具体实施例中，所述sgRNA的靶序列如序列10所示。
[0010]上述方法可包括如下步骤：
[0011](1)将能够表达所述dCas9
‑
KRAB融合蛋白的重组慢病毒A感染所述肺癌细胞，得到阳性细胞系；
[0012](2)向步骤(1)所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA和所述MS2
‑
P65
‑
HSF1融合蛋白的重组慢病毒B。
[0013]进一步的，所述(1)中，所述阳性细胞系为经嘌呤霉素(Puromycin)筛选后得到dCas9蛋白相对表达量最高的细胞系。
[0014]所述能够表达所述dCas9
‑
KRAB融合蛋白的重组慢病毒A可为将含有所述dCas9
‑
KRAB融合蛋白编码基因的慢病毒载体进行包装后得到的慢病毒。
[0015]所述能够表达所述sgRNA和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白的重组慢病毒B可为将含有所述sgRNA编码基因和所述MS2
‑
P65
‑
HSF1融合蛋白编码基因的慢病毒载体进行包装后得到的慢病毒。
[0016]更进一步的，含有所述dCas9
‑
KRAB融合蛋白编码基因的慢病毒载体为lenti
‑
EF1a
‑
dCas9
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KRAB
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Puro。
[0017]含有所述sgRNA编码基因和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白编码基因的慢病毒载体为将sgRNA靶序列的编码基因插入慢病毒载体GV419(U6
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sgRNA
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SV40
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MS2
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P65
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HSF1
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T2A
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Neo)后得到的载体。
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[0018]上述方法中，所述肺癌细胞具体可为A549细胞。
[0019]本专利技术的另一个目的是提供按照上述方法制备得到的肺癌细胞。
[0020]本专利技术的最后一个目的是提供如下1)
‑
9)任一种应用：
[0021]1)上述任一所述方法在抑制肺癌细胞中LTR5Hs序列表达中的应用；
[0022]2)上述任一所述方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增殖速度提高的肺癌细胞的制备方法，包括如下步骤：使肺癌细胞中表达dCas9
‑
KRAB融合蛋白、MS2
‑
P65
‑
HSF1融合蛋白和靶向LTR5Hs序列第83
‑
89位的sgRNA；所述LTR5Hs序列如序列1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA的靶序列如序列10所示。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)将能够表达所述dCas9
‑
KRAB融合蛋白的重组慢病毒A感染所述肺癌细胞，得到阳性细胞系；(2)向步骤(1)所得阳性细胞系中导入能够表达所述sgRNA和所述MS2
‑
P65
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HSF1融合蛋白的重组慢病毒B。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述能够表达所述dCas9
‑
KRAB融合蛋白的重组慢病毒A为将含有所述dCas9
‑
KRAB融合蛋白编码基因的慢病毒载体进行包装后得到的慢病毒。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：含有所述dCas9
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KRAB融合蛋白编码基因的慢病毒载体为lenti
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EF1a
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dCas9
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KRAB
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Puro。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述能够表达所述sgRNA和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白的重组慢病毒B为将含有所述sgRNA编码基因和所述MS2
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P65
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HSF1融合蛋白编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，刘梦莹，贾磊，王阳蓝，张伯寒，李韩平，刘永健，韩婧婉，王晓林，李敬云，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：