一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品及其构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体为一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品及其构建方法，至少搭载RNAi靶点序列RNAi

【技术实现步骤摘要】
一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品及其构建方法。

技术介绍

[0002]前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，在国内外许多研究者均努力开发可在肿瘤细胞中特异性复制表达的病毒载体，例如试图通过改造慢病毒基因组本身达到此目的，或试图通过修饰慢病毒的纤毛结构来达到此目的，慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以在体内较长期的表达且安全性高。中国专利(授权公告号为CN102154369B)公开了一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及含有该重组慢病毒的干细胞，在慢病毒载体的多克隆位点顺序插入Survivin启动子、Apoptin基因和SV40 Poly A序列实现其对转化细胞特异性预警、反应、示踪、清除的功能，但是未针对前列腺癌细胞的抑制和清除进行特异性设计。

技术实现思路

[0003]为了解决上述问题，本专利技术一方面提供了一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品，至少搭载RNAi靶点序列RNAi
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21904、RNAi
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21905、RNAi
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21906中的一种，其中RNAi
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21904、RNAi
‑
21905、RNAi
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21906片段编码序列分别为：AAGGACATGGCCACAGAAACA、CTTGATATTGGGCTAGAATTA、ATTGGATAAGCTTGTCAATGA。优选的，所述慢病毒产品搭载的RNAi靶点序列为RNAi
‑
21904。
[0004]参见表1、图1，所述RNAi靶点序列通过内源筛靶实验获得，通过内源筛靶实验，从定量PCR结果可以看出，人前列腺癌细胞(DU 145细胞)中，感染慢病毒后，相对于感染阴性对照慢病毒的正常目的细胞组(shCtrl)，shTDRKH
‑
1组(感染目的基因(RNAi
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21904)慢病毒的正常目的细胞组)TDRKH基因敲减效率达到69.5％(p<0.001)。shTDRKH
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2组(感染目的基因(RNAi
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21905)慢病毒的正常目的细胞组)TDRKH基因敲减效率不显著。shTDRKH
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3组(感染目的基因(RNAi
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21905)慢病毒的正常目的细胞组)TDRKH基因敲减效率达到67.6％(p<0.001)。
[0005]表1、
[0006][0007]参见表2、图2，所述人前列腺细胞(DU 145细胞)通过本底检测确定，通过本底检测实验，从定量PCR结果可以看出，相对于C4
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2细胞，基因在细胞DU 145，PC
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3中的表达相对较高(P<0.001)，基因在细胞22RV1，LNcap中无明显变化。
[0008]表2、
[0009][0010]作为一种优选的技术方案，所述RNAi靶点序列搭载于工具载体上，所述工具载体为BR
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V108、BR
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V307、BR
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V112中的一种。优选的，所述工具载体为BR
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V108，来源于上海懿贝瑞生物医药有限公司。
[0011]本专利技术另一方面提供了一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品的构建方法，包
括：载体酶切、目的基因片段的获取、退火产物与载体进行连接、转化、菌落PCR鉴定、测序。
[0012]作为一种优选的技术方案，所述载体酶切反应温度为25
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75℃，所述载体酶切反应时间为3
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12h。优选的，所述载体酶切反应温度为37℃，所述载体酶切反应时间为3h。
[0013]作为一种优选的技术方案，所述目的基因片段的获取至少包括单链引物合成、引物退火形成双链DNA。
[0014]作为一种优选的技术方案，所述引物退火形成双链DNA具体为：将合成的成对的引物干粉溶解于去离子水中，用PCR仪90
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100℃加热4
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6分钟，之后在92
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95℃下保温50
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60s，再梯度降温，最后降温到25℃。优选的，所述引物退火形成双链DNA具体为：将合成的成对的引物干粉溶解于去离子水中，用PCR仪95℃加热5分钟，之后在95℃下保温50s，再梯度降温，每次降温0.7℃，最后降温到25℃。
[0015]作为一种优选的技术方案，所述退火产物与载体进行连接具体为：将引物退火形成的双链DNA与酶切后的载体在10
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20℃的条件下反应1
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3h后实现退火产物与载体的连接。优选的，所述退火产物与载体进行连接具体为：按照Fermentas T4 DNA Ligase说明书配制20μL反应体系，将引物退火形成的双链DNA与酶切后的载体在16℃的条件下反应1
‑
3h后实现退火产物与载体的连接。
[0016]作为一种优选的技术方案，所述转化具体为：将退火产物与载体进行连接后的产物加入至大肠杆菌感受态细胞中冰浴20
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40min；之后进行热激并冷却后，加入培养基培养后即可完成转化。
[0017]作为一种优选的技术方案，所述热激温度为40
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45℃，热激时间为80
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100s，冷却时间为100
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150s。优选的，所述热激温度为42℃，热激时间为90s，冷却时间为120s。
[0018]作为一种优选的技术方案，所述菌落PCR鉴定的反应条件为：92
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96℃，2
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4min；92
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96℃，20
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40s，50
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60℃，20
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40s，70
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75℃，20
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40s，22次循环；70
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75℃，4
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6min。
[0019]有益效果：
[0020]1、本专利技术提供了一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品，能够有效抑制前列腺癌细胞的表达、增殖、迁移和转化，为前列腺癌症患者症状的缓解以及后续治疗提供了新的方向。
[0021]2、本专利技术提供的具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品，通过搭载特定RNAi靶点序列，实现对TDRKH基因的高敲减效率，降低前列腺癌细胞自我复制的能力，保证慢病毒产品对前列腺癌细胞的抑制作用。
[0022]3、本专利技术提供的具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品，细胞感染效率高达80％以上，且细胞状态正常，具有较高的安全性和稳定性。
附图说明
[0023]图1为内源本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品，其特征在于，至少搭载RNAi靶点序列RNAi
‑
21904、RNAi
‑
21905、RNAi
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21906中的一种，其中RNAi
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21904、RNAi
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21905、RNAi
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21906片段编码序列分别为：AAGGACATGGCCACAGAAACA、CTTGATATTGGGCTAGAATTA、ATTGGATAAGCTTGTCAATGA。2.根据权利要求1所述的具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品，其特征在于，所述RNAi靶点序列搭载于工具载体上，所述工具载体为BR
‑
V108、BR
‑
V307、BR
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V112中的一种。3.一种根据权利要求1或2所述的具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品的构建方法，其特征在于，包括：载体酶切、目的基因片段的获取、退火产物与载体进行连接、转化、菌落PCR鉴定、测序。4.根据权利要求3所述的具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品的构建方法，其特征在于，所述载体酶切反应温度为25
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75℃，所述载体酶切反应时间为3
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12h。5.根据权利要求3所述的具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品的构建方法，其特征在于，所述目的基因片段的获取至少包括单链引物合成、引物退火形成双链DNA。6.根据权利要求5所述的具有前列腺癌抑制作用的慢病毒产品的构建方法，其特征在于，所述引物退火形成双链DNA具体为：将合成的成对的引物干粉溶解于去离子水中，用PCR仪90
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【专利技术属性】
技术研发人员：王飞飞，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书八页序列表电子公布附图五页，
类型：发明
国别省市：