一种负载紫杉醇的CAR-T外泌体在制备雾化吸入法原位治疗肺癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体公开了一种负载紫杉醇的CAR

【技术实现步骤摘要】
一种负载紫杉醇的CAR
‑
T外泌体在制备雾化吸入法原位治疗肺癌药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体公开了一种负载紫杉醇的CAR
‑
T外泌体在制备雾化吸入法原位治疗肺癌药物中的应用。

技术介绍

[0002]在过去十几年中，肺癌一直全球范围内发病率最高的癌症，5年存活率仅10％
‑
15％。肺癌的常规治疗方法主要包括手术、化疗和放疗。随着近十多年来肿瘤免疫学的快速发展，免疫疗法在肿瘤治疗中的地位越来越重要。其中以CAR
‑
T细胞为代表的过继性细胞疗法在肿瘤的治疗中也取得了非常重要的进展。
[0003]CAR
‑
T细胞疗法在血液瘤中取得了不错的疗效，但在肺癌等实体瘤中的疗效却不尽人意。研究者发现有以下原因：其一可及性问题，CAR
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T需要穿透肿瘤脉管系统、基质等才能接触到肿瘤细胞，难以浸润到肿瘤微环境；其二肿瘤微环境的抑制，调节性T细胞、检查抑制点PD
‑
L1、腺苷等皆可抑制CAR
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T细胞杀肿瘤效果；其三细胞因子风暴，即使可以通过各种修饰手段增强CAR
‑
T细胞的增殖能力和杀伤能力，过强的CAR
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T细胞又会引发以释放大量IL
‑
6为特征的细胞因子释放综合症、神经毒症等；其四肿瘤抗原异质性引发的肿瘤免疫逃逸等。
[0004]由于外泌体具有生物相容性好、易修饰、易穿透生物屏障和可装载药物等特性，近年来已在癌症治疗中起越来越重要的作用。研究者发现，CAR
‑
T细胞来源的外泌体表面表达了对肿瘤细胞具有靶向性的CAR蛋白。针对于以上提及的CAR
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T细胞治疗实体瘤面临的四大难题，利用CAR
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T来源的外泌体可以逐一克服：针对可及性问题，外泌体直径约30
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150nm，具有脂溶性易通过物理屏障；针对肿瘤微环境抑制，外泌体不受调节性T细胞、检查抑制点PD
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L1等抑制因素调控；针对细胞因子风暴，外泌体可定量给药，而且不扩增；针对肿瘤抗原异质性，外泌体可携带药物协同抗癌减少肿瘤免疫逃逸。目前CAR
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T细胞来源的外泌体联合化疗药物针对肺癌的治疗还未见报道。

技术实现思路

[0005]针对目前现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种负载紫杉醇的CAR
‑
T外泌体在制备雾化吸入法原位治疗肺癌药物中的应用。利用CAR
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T外泌体负载肺癌临床化疗一线药物紫杉醇，既可以提高靶向杀肿瘤效果，又可以降低化疗药物副作用。
[0006]本专利技术的第一个目的在于提供一种负载紫杉醇的CAR
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T外泌体。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供一种负载紫杉醇的CAR
‑
T外泌体的制备方法。
[0008]本专利技术的第三个目的在于提供一种负载紫杉醇的CAR
‑
T外泌体在制备雾化吸入法原位治疗肺癌药物中的应用。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]一种负载紫杉醇的CAR
‑
T外泌体的制备方法，包括以下步骤：
[0011]S1、构建含有靶向MSLN的CAR序列的质粒，将所得质粒进行慢病毒包装；
[0012]S2、分离和激活T细胞，使用步骤S1所得慢病毒转染T细胞，得到CAR
‑
T细胞；
[0013]S3、培养扩增步骤S2所述CAR
‑
T细胞，收集上清，离心获得外泌体；
[0014]S4、将紫杉醇(PTX)负载于步骤S3所述外泌体中。
[0015]优选地，步骤S1所述慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统。
[0016]优选地，步骤S2所述T细胞来自健康人源外周血。
[0017]优选地，步骤S2采用CD3/28单抗偶联磁珠激活T细胞。
[0018]优选地，步骤S3所述培养具体为：培养体系中包含添加100U/mL rMuIL
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2，每2
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3天更换一次培养基，直到细胞生长至90％汇合，即需传代；通过换液法进行传代，根据细胞密度将细胞悬液平分至培养瓶中，使每瓶细胞密度达到参考传代密度，并补足新鲜的培养基。
[0019]优选地，步骤S4所述负载方法为电穿孔。
[0020]本专利技术还提供了上述负载紫杉醇的CAR
‑
T外泌体在制备治疗肺癌药物中的应用。
[0021]优选地，所述药物剂型为冻干雾化制剂，给药方式为雾化吸入法。
[0022]雾化吸入外泌体已被应用多种肺部疾病的治疗，在ARDS、肺纤维化中均取得了不错的疗效，雾化吸入的优势有以下：其一，吸入方式的物理靶向性使得药物在肺的局部浓度提高；其二吸入的药物不用先经过肝肾等器官，可减少药物代谢从而提高药物利用率；其三可同时减少毒副作用从而降低全身不良反应。这为雾化吸入CAR
‑
T外泌体治疗原位肺癌提供了有力的科学佐证。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0024]本专利技术在医学上应用意义主要是第一次把CAR
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T细胞进行包括培养、鉴定、纯化、提取外泌体、装载化疗药物，制成冻干制剂。用雾化吸入的方法治疗因不同因素所致的肺癌。使用高浓度的CAR
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T细胞外泌体直接通过雾化器吸入肺部，直接作用于肺部组织，可提高外泌体的利用效率、降低化疗药物全身性的毒副作用，调节免疫微环境进而提高抗肿瘤效果。
附图说明
[0025]图1为本专利技术MSLN CAR
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T的结构示意图。
[0026]图2为本专利技术MSLN CAR
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T克隆形成图。
[0027]图3为本专利技术制备的CAR
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EXO及CAR
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EXO@PTX表征验证图。
[0028]图4为本专利技术制备的CAR
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EXO@PTX细胞毒性试验结果。
[0029]图5为本专利技术CAR
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EXO@PTX体外肿瘤细胞杀伤结果图。
[0030]图6为本专利技术雾化吸入CAR
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EXO@PTX治疗原位肺癌小鼠后对小鼠生存率的影响图。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]本专利技术实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、
试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载紫杉醇的CAR
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T外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、构建含有靶向MSLN的CAR序列的质粒，将所得质粒进行慢病毒包装；S2、分离激活T细胞，使用步骤S1所得慢病毒转染T细胞，得到CAR
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T细胞；S3、培养扩增步骤S2所述CAR
‑
T细胞，收集上清，离心获得外泌体；S4、将紫杉醇负载于步骤S3所述外泌体中。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述T细胞来自健康人源外周血。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2采用CD3/28单抗偶联磁珠激活T细胞。5.根据权利要求1所述的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，郑葳，
申请(专利权)人：钦源再生医学广东有限公司，
类型：发明
国别省市：