【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，更具体的，涉及工程化外泌体及其在快速生成car-t细胞中的应用。
技术介绍
1、癌症是全球健康的重大挑战，其发病率和死亡率不断升高。据世界卫生组织(who)报告，癌症是全球死亡的主要原因之一，每年导致数百万人死亡。传统的癌症治疗方法包括手术、放疗和化疗，但这些治疗常常伴随着重大的副作用和复发的高风险。近年来，针对特定癌症类型的靶向治疗和免疫治疗提供了新的治疗方案，但对于许多患者来说，治疗效果仍然有限。因此，迫切需要一种新型的治疗方法以改善肿瘤患者的预后。
2、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell，car-t)疗法是一种采用基因工程技术的免疫疗法。在这种疗法中，患者的t细胞被提取并通过逆转录病毒或其他载体系统转导以表达特定的嵌合抗原受体(car)。这些car是人工设计的蛋白质，能够特异性识别并结合到肿瘤细胞表面的抗原，从而激活t细胞对这些靶细胞的攻击。car-t细胞疗法在某些血液肿瘤治疗中取得了显著的突破，尤其是在治疗难治性或复发性的急性淋巴细胞白血病(all)和某些类型的非霍奇金淋巴瘤(nhl)中表现出高效的疗效。这些成就主要归功于car-t细胞对特定癌症标志物的高度特异性，如cd19，这是大多数b细胞肿瘤细胞表面表达的一个抗原。然而，car-t细胞疗法在实体瘤治疗中面临诸多挑战。实体瘤的微环境具有免疫抑制特性，限制了car-t细胞的渗透和功能。此外，实体瘤的异质性和缺乏高度特异性的肿瘤相关抗原增加了靶向的复杂性和安全风险。这些因素导致了car-
3、细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是一类由细胞释放到外部环境中的膜包裹小体。它们在大小、起源和组成上有所不同，可分为几种类型，包括外泌体(exosomes)、微泡(microvesicles)和凋亡体(apoptotic bodies)。evs自然存在于多种体液中，如血液、尿液和唾液，并在细胞间的通讯中发挥作用，转运蛋白质、脂质和核酸等生物大分子。由于细胞外囊泡具有高生物相容性、低免疫原性、易修饰性和良好的负载能力，目前已作为递送载体被广泛应用。在药物递送方面，evs特别适合用于递送不稳定的生物大分子，如mrna。evs能够很好地保护mrna、防止mrna被血液中的核酸酶降解。此外，通过基因工程技术，可以进一步增强evs的靶向递送能力。例如，通过基因工程化技术使evs表面表达可以识别特定肿瘤抗原的抗体或配体，可以增强其在靶向癌症治疗中的应用潜力。因此，通过基因工程改造的evs有望用于mrna的递送，进而用于在体内制备car-t细胞。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，提供一种种可以直接制备car-t的工程化外泌体，该外泌体具有良好的t细胞靶向性、激活t细胞的能力和rna结合能力。
2、本专利技术的第二个目的是提供利用该工程化外泌体制备可以表达嵌合抗原受体的t细胞。
3、本专利技术的第三个目的是提供上述可以表达嵌合抗原受体的t细胞的应用。
4、本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
5、一种能够直接快速生成car-t细胞的工程化外泌体，所述工程化外泌体表面同时表达能够识别并激活t细胞的双特异性单链可变片段cd3/cd28 scfv和能与mrna结合的rna结合肽l7ae/cd63；所述编码cd3/cd28 scfv的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述编码rna结合肽l7ae/cd63的核苷酸序列如seq id no：2所示。
6、信使rna(mrna)是一种单链rna分子，它携带从dna转录而来的遗传信息，并在细胞质的核糖体上指导蛋白质的合成。mrna是从基因转录的产物，它携带特定的氨基酸序列信息，用于合成特定的蛋白质。在肿瘤治疗领域，mrna被用作一种治疗工具，以编码抗癌蛋白或肿瘤抗原。这些编码的蛋白质可以激活患者的免疫系统，使其能够识别和攻击癌细胞。例如，mrna疫苗可以编码肿瘤特异性抗原，激发免疫应答以针对特定的癌症。重要的是，目前已有许多研究者尝试通过将mrna导入至t细胞，直接生成瞬时表达的car-t细胞。然而，这种方法仅限于体外制备。将mrna用于体内制备car-t细胞尚存在许多困难。其中，mrna的有效递送到靶细胞是实现其疗效的关键挑战之一。由于mrna在体内不稳定，易被酶降解，并且无法轻易穿过细胞膜，因此需要使用特殊的载体进行递送。常用的递送系统包括病毒载体、脂质纳米颗粒(lnps)、聚合物和裸露的mrna。然而，这些载体存在一定免疫原性，且缺乏靶向性。因此，急需开发一种新型的递送载体，将mrna递送至t细胞中，进而生成car-t细胞。
7、cd3是t细胞受体(tcr)复合体的一部分，对t细胞的激活和信号传导至关重要。cd3复合体由几个不同的蛋白亚单位组成，它与tcr共同工作，传递抗原识别信号，从而激活t细胞。cd3在所有成熟t细胞的表面上都有表达，是t细胞成熟和功能的关键组成部分。cd28是t细胞表面的一种共刺激分子，对t细胞的完全激活至关重要。cd28通过与其配体(如b7-1和b7-2)的结合，增强tcr信号，促进t细胞的增殖、分化和生存。cd28的信号途径对于有效的免疫应答和t细胞的抗肿瘤活性尤为重要。目前已开发出多种针对cd3和cd28的单克隆抗体，这些抗体主要用于增强t细胞反应。通过靶向cd3和cd28，研究人员正在开发新的方法来增强t细胞的抗肿瘤活性。例如，将抗体药物偶联物(adcs)或其他治疗剂与针对cd3或cd28的抗体结合，可以直接将药物递送到t细胞，激活它们对抗肿瘤。在细胞治疗，尤其是在car-t细胞疗法的制备过程中，利用针对cd3和cd28的抗体激活和扩增t细胞是一个关键步骤。通过体外刺激t细胞，这些抗体能够增强t细胞的增殖和活化，从而为后续的遗传改造和肿瘤靶向治疗打下基础。因此，在外泌体上表达针对cd3和cd28的scfv，有望提高外泌体对t细胞的靶向性，同时激活t细胞。
8、rna结合肽是一类特殊的肽类分子，能够与rna分子特异性结合。这些肽通过识别rna的特定序列或结构，与之结合，从而影响rna的功能或稳定性。在自然界中，rna结合肽参与各种生物学过程，如rna的剪接、转运、定位和降解。其中，l7ae是一种特定的rna结合肽，属于一类能够识本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够直接快速生成CAR-T细胞的工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体表面同时表达能够识别并激活T细胞的双特异性单链可变片段CD3/CD28 scFv和能与mRNA结合的RNA结合肽L7Ae/CD63；所述编码CD3/CD28 scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述编码RNA结合肽L7Ae/CD63的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种慢病毒表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的核苷酸序列SEQ IDNO.1和/或核苷酸序列SEQ ID NO：2。
3.权利要求1所述工程化外泌体在制备嵌合抗原受体修饰的T细胞中的应用。
4.一种制备嵌合抗原受体修饰T细胞的方法，其特征在于，包含如下步骤：
5.权利要求4所述方法得到的嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种能够直接快速生成car-t细胞的工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体表面同时表达能够识别并激活t细胞的双特异性单链可变片段cd3/cd28 scfv和能与mrna结合的rna结合肽l7ae/cd63；所述编码cd3/cd28 scfv的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述编码rna结合肽l7ae/cd63的核苷酸序列如seq id no：2所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，朱天川，
申请(专利权)人：钦源再生医学广东有限公司，
类型：发明
国别省市：
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