【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗生产，更具体地，涉及一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法。
技术介绍
1、水痘病毒的全称为水痘-带状疱疹病毒，人体初次感染该病毒可导致原发性感染，引发水痘，多见于儿童，在疾病痊愈后，该病毒可继续潜伏于人体脊髓后跟和脑神经的感觉神经节细胞之中，当细胞免疫力降低时，当病毒会再次被激活，然后沿感觉神经轴突到达所支配的皮肤细胞，并在其内增殖，从而引发带状疱疹。水痘疫苗是经水痘病毒传代毒株制备而成，是预防水痘感染的唯一手段，接种水痘疫苗不仅能预防水痘，还能预防因水痘带状疱疹而引起的并发症。
2、目前，水痘减毒活疫苗采用人二倍体细胞作为该病毒培养的细胞基质，该细胞基质已在疫苗生产中使用40多年，如中国专利cn104188923a提出一种新型冻干水痘减毒活疫苗的生产方法包括以下步骤：1)人二倍体细胞株的复苏和传代培养；2)人二倍体细胞使用微载体在生物反应器中培养；3)接种水痘病毒oka株，病毒增殖，待细胞病变达到75％以上时准备收获水痘病毒培养液，得到初步培养液；4)向所述初步培养液中加入冻干保护剂，收获水痘病毒培养液，经纯化后配制成水痘疫苗原液；5)将上述水痘疫苗原液分装，冻干，即得到所述的新型冻干水痘减毒活疫苗。本领域技术人员在实施该专利方法时发现，一方面，人二倍体细胞细胞基质一般生长至单层后增殖缓慢，并且出现衰老，在培养皿上的细胞密度、生长状态以及细胞的维持时间都影响着病毒的产量，且病变时容易呈现病变感染不均匀，部分细胞未被感染从而降低细胞的利用率，部分细胞感染过度容易脱落，损失病毒液；另一方面，病毒收
技术实现思路
1、基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，包括以下步骤：使用混合培养基进行培养得到高密度、维持时间长的人二倍体细胞，接种水痘-带状疱疹病毒oka株毒种进行首次培养，培养至病变前期使用高浓度重组胰蛋白酶对携带病毒的细胞重新消化，使病变细胞均匀分布后进行二次培养后，根据细胞病变程度采用不同浓度的重组胰蛋白酶进行多次培养及消化收获，最后将病毒收获液冻存；所述人二倍体细胞培养以及接种病毒后的培养液均由混合培养基和牛血清组成。
3、进一步地，所述混合培养基由mem培养基、百奥特d126c培养基和源培hdc培养基按照体积百分比40％～60％：25～35％：15％～25％组成。
4、进一步地，所述人二倍体细胞为mrc-5细胞，传代比例为1：2～1：4。
5、进一步地，所述人二倍体细胞mrc-5的传代的培养液由混合培养基和牛血清按照体积比为88％～92％：8％-12％组成。
6、进一步地，接种水痘-带状疱疹病毒oka株毒种后的细胞首次培养、病变前期重新消化后的二次培养和根据细胞病变程度多次消化培养步骤中，培养液均由混合培养基和牛血清按照体积比为97％～99％：1％～3％组成。
7、进一步地，按moi 0.01～0.1对mrc-5细胞接种病毒接种水痘-带状疱疹病毒oka株毒种并进行首次培养，待细胞病变达5％～10％时用高浓度重组胰蛋白酶消化后继续进行细胞的二次培养，本步骤中通过将细胞重新消化，使携带病毒的细胞在培养液中重新分布，使病变细胞更加均匀，能够提高最终病变细胞的密度。
8、进一步地，待二次培养细胞病变达40％～60％时，用低浓度重组胰蛋白酶进行第一次消化，待细胞表层剥落30％～40％时第一次收获；继续培养未脱落细胞至病变达40％～60％时，用低浓度重组胰蛋白酶进行第二次消化，待细胞表层剥落45％～55％时第二次收获；继续培养未脱落细胞至病变达75％以上时，用高浓度的重组胰蛋白酶进行第三次消化收获。本步骤中的多次收获选用消化力度温和的重组胰酶，在特定浓度下达到理想的消化分离效果，实现细胞的层层剥落。
9、进一步地，所述高浓度重组胰蛋白酶的浓度是为0.2～0.4mg/ml。
10、进一步地，所述低浓度重组胰蛋白酶的浓度是0.1～0.2mg/ml。
11、进一步地，将多次收获的细胞悬液于2～8℃、3000～4000rpm离心8～10分钟，取下层沉淀，加入病毒保护液重悬并冻存于-60℃以下。
12、与现有技术相比，本专利技术有以下有益效果：
13、本专利技术创造性地提供了混合培养基，以混合培养基为基础，能极大的提高细胞的密度及维持时间，解决细胞单层后增值缓慢易衰老脱落问题，为后续提高病毒的产量奠定基础；结合本专利技术对病毒接种细胞采用二次培养手段，在首次培养细胞病变达到5％～10％时，对细胞重新消化后进行二次培养，使携带病毒的细胞再次分配，细胞病变更加均匀，提高细胞的感染率和利用率；最后再结合本专利技术的根据细胞病变程度采用不同浓度重组胰蛋白酶进行多次消化、多次培养、多次收获手段，减少病毒液脱落损失，提高病毒扩增空间，都极大地促进了病毒的产量的提升，细胞利用基本达到饱和，节约生产过程中的原材料成本。
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1.一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使用混合培养基进行培养得到高密度、维持时间长的人二倍体细胞，接种水痘-带状疱疹病毒Oka株毒种进行首次培养，培养至病变前期使用高浓度重组胰蛋白酶对携带病毒的细胞重新消化，使病变细胞均匀分布后进行二次培养后，根据细胞病变程度采用不同浓度的重组胰蛋白酶进行多次培养及消化收获，最后将病毒收获液冻存。
2.根据权利要求1所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述混合培养基由MEM培养基、百奥特D126C培养基和源培HDC培养基按照体积百分比40％～60％：25～35％：15％～25％组成。
3.根据权利要求1所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述人二倍体细胞为MRC-5细胞，传代比例为1：2～1：4。
4.根据权利要求3所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述人二倍体细胞MRC-5的传代的培养液由混合培养基和牛血清按照体积比为88％～92％：8％-12％组成。
5.根据权利要求1所述的一种提高水痘减
6.根据权利要求所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，按MOI 0.01～0.1对MRC-5细胞接种病毒接种水痘-带状疱疹病毒Oka株毒种并进行首次培养，待细胞病变达5％～10％时用高浓度重组胰蛋白酶重新消化，使病变细胞均匀分布后进行二次培养。
7.根据权利要求5所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，待二次培养细胞病变达40％～60％时，用低浓度重组胰蛋白酶进行第一次消化，待细胞表层剥落30％～40％时第一次收获；继续培养未脱落细胞至病变达40％～60％时，用低浓度重组胰蛋白酶进行第二次消化，待细胞表层剥落45％～55％时第二次收获；继续培养未脱落细胞至病变达75％以上时，用高浓度的重组胰蛋白酶进行第三次消化收获。
8.根据权利要求6或7所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述高浓度重组胰蛋白酶的浓度是为0.2～0.4mg/ml。
9.根据权利要求7所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述低浓度重组胰蛋白酶的浓度是0.1～0.2mg/ml。
10.根据权利要求1所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，将根据细胞病变程度进行多次消化收获的细胞悬液于2～8℃、3000～4000rpm离心8～10分钟，取下层沉淀，加入病毒保护液重悬并冻存于-60℃以下。
...【技术特征摘要】
1.一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：使用混合培养基进行培养得到高密度、维持时间长的人二倍体细胞，接种水痘-带状疱疹病毒oka株毒种进行首次培养，培养至病变前期使用高浓度重组胰蛋白酶对携带病毒的细胞重新消化，使病变细胞均匀分布后进行二次培养后，根据细胞病变程度采用不同浓度的重组胰蛋白酶进行多次培养及消化收获，最后将病毒收获液冻存。
2.根据权利要求1所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述混合培养基由mem培养基、百奥特d126c培养基和源培hdc培养基按照体积百分比40％～60％：25～35％：15％～25％组成。
3.根据权利要求1所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述人二倍体细胞为mrc-5细胞，传代比例为1：2～1：4。
4.根据权利要求3所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，所述人二倍体细胞mrc-5的传代的培养液由混合培养基和牛血清按照体积比为88％～92％：8％-12％组成。
5.根据权利要求1所述的一种提高水痘减毒活疫苗病毒产量的制备方法，其特征在于，接种水痘-带状疱疹病毒oka株毒种后的细胞首次培养、病变前期重新消化后的二次培养和根据细胞病变程度多次消化培养步骤中，培养液均由混合培养基和牛血清按照体积比为97％～99％：1％～3％组成。
...【专利技术属性】
技术研发人员：陈楚如，王义民，贾新年，王雪云，洪玮琪，刘栩祥，曹静，赖婵丹，郭土敬，
申请(专利权)人：深圳市卫光生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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