【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于毒素检测，尤其涉及一种相思子毒素的快速检测方法。
技术介绍
1、相思子毒素(abrin toxin，at)是从豆科藤本植物相思豆种子中提取的毒素蛋白。at可以通过食物、水或气溶胶传播，抑制蛋白质合成，并通过直接膜损伤、细胞凋亡途径、促进细胞因子释放等导致细胞死亡，发挥毒性作用。蓖麻毒素(ricin toxin，rt)的结构和生物学特性与at十分相似，at与rt均属于ⅱ型核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein，rip)，具有n-糖苷酶活性，可特异性且不可逆地水解生物的核糖体28s rrna上的腺嘌呤(a4324)，导致核糖体无法与延长因子结合，从而抑制核糖体的翻译功能，抑制蛋白质合成，进而发挥毒性作用。该酶活性能够在体外作用于含腺嘌呤的寡核苷酸链，使得腺嘌呤脱落，并在相应的位置形成碱基缺失位点(apurinic/apyrimidinic site，ap site)。
2、毒素的酶活性不仅在生物体内发挥重要的作用，还通常会被用作检测手段的一种。at便通常利用其酶活性进行检测方法的建立，主要基于其n-糖苷酶活性作用于不同类型的含腺嘌呤的核酸底物，再通过质谱技术等检测腺嘌呤的含量。这种方法的优势主要在于特异性强、灵敏度高，能够检测rt和at是否具有毒性，但是该方法从毒素与底物的孵育，再到上机检测往往需要约2-5h的时间(孵育时间长短取决于样本中毒素的含量)，耗时长，不利于快速检测，且仪器昂贵、成本高。另外也有学者通过结合电化学传感器、细胞毒性等方法实现对at的检测，但是应用范围
3、目前对于at的酶特性研究仅仅主要围绕n-糖苷酶活性，检测方法多以质谱方法为主。若能基于at的n-糖苷酶以外的酶特性开发具有高特异性与灵敏度且操作简单，能够快速准确、高效的检测方法，有利于降低检测成本，大大缩短检测时间，实现现场快速检测。因此，对at的检测、鉴定和表征各种样品基质中at具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种at的快速检测方法，以解决现有技术中at检测方法时间长、应用范围窄以及灵敏度低等问题。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种at的快速检测方法，包括以下步骤：
4、将标记荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸链底物、缓冲液、bsa溶液、待测样品和无菌水反应后，进行恒温孵育，检测荧光信号值，根据最终荧光信号值的平均值与阴性对照最终荧光信号值平均值的差值确定是否存在相思子毒素；
5、所述待测样品使用抗体包被的磁珠进行富集。
6、优选的，所述标记荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸链底物、缓冲液、bsa溶液、待测样品和无菌水的用量分别为0.5～6μl。
7、优选的，所述抗体与磁珠的包被量为20～30μg抗体包被0.5～2mg磁珠。
8、优选的，所述缓冲液包括甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液、柠檬酸铵缓冲液、乙酸铵+edta缓冲液或柠檬酸铵+edta缓冲液。
9、优选的，所述标记荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸链底物的终浓度为2～20μm；所述甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液和柠檬酸铵缓冲液的终浓度分别为0.2～20mm；所述乙酸铵+edta缓冲液中乙酸铵的终浓度为0.2～20mm，edta的终浓度为0.2～0.8mm；所述柠檬酸铵+edta缓冲液中柠檬酸铵的终浓度为0.2～20mm，edta的终浓度为0.2～0.8mm；所述bsa溶液的终浓度为10～100μg/ml。
10、优选的，所述反应的ph为3.5～4.8，所述反应的温度为40～75℃，所述反应的时间为30～50min。
11、优选的，所述恒温孵育时荧光信号值检测次数为2～5次。
12、优选的，所述检测的最终荧光信号值的平均值大于阴性对照最终荧光信号值平均值+3倍标准差即可判定为阳性样本。
13、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
14、本专利技术首次明确了相思子毒素(abrin toxin，at)能够作用于脱腺嘌呤后的寡核苷酸链上的碱基缺失位点(apurinic/apyrimidinic site，ap site)，具有ap裂解酶活性，并依托该酶活性建立了基于荧光信号值检测的新型at检测方法。该方法反应体系组成成分简单，只包括bsa溶液、缓冲液、进行了荧光猝灭基团修饰的寡核苷酸底物、毒素和无菌水。反应原理是at首先发挥其n-糖苷酶活性，作用于寡核苷酸链上的腺嘌呤，然后进一步发挥ap裂解酶活性使得寡核苷酸底物断裂，同时进行荧光信号值的检测。
15、本专利技术设计了多种类型的底物，并通过对反应体系的组成成分、浓度、底物类别，反应体系的大小、反应温度和反应时间等进行优化，建立了一种快速高效的at检测方法。优化后，该检测方法只需在63℃下恒温孵育40min即可完成检测。灵敏度高，将样本直接加入到反应体系中时，该方法检测灵敏度可达到30ng/ml，使用包被抗体的磁珠进行富集后检测，灵敏度可达到0.3125ng/ml，且特异性强，与rt不存在交叉反应。
16、本专利技术的反应体系成分及反应条件简单，反应时间短，且不需要昂贵的检测仪器和复杂的专业操作，突破了目前at检测方法的技术壁垒，可用于现场快速筛查以及体外at中毒样本的快速检测。
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1.一种相思子毒素的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述标记荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸链底物、缓冲液、BSA溶液、待测样品和无菌水的用量分别为0.5～6μL。
3.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述抗体与磁珠的包被量为20～30μg抗体包被0.5～2mg磁珠。
4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述缓冲液包括甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液、柠檬酸铵缓冲液、乙酸铵+EDTA缓冲液或柠檬酸铵+EDTA缓冲液。
5.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述标记荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸链底物的终浓度为2～20μM；所述甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液和柠檬酸铵缓冲液的终浓度分别为0.2～20mM；所述乙酸铵+EDTA缓冲液中乙酸铵的终浓度为0.2～20mM，EDTA的终浓度为0.2～0.8mM；所述柠檬酸铵+EDTA缓冲液中柠檬酸铵的终浓度为0.2～20mM，EDTA的终浓度为0.2～0.8mM；所述BSA溶液的终浓度为10～100μg/mL。
6.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述反应的pH为3.5～4.8，所述反应的温度为40～75℃，所述反应的时间为30～50min。
7.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述恒温孵育时荧光信号值检测次数为2～5次。
8.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述检测的最终荧光信号值的平均值大于阴性对照最终荧光信号值平均值+3倍标准差即可判定为阳性样本。
...【技术特征摘要】
1.一种相思子毒素的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述标记荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸链底物、缓冲液、bsa溶液、待测样品和无菌水的用量分别为0.5～6μl。
3.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述抗体与磁珠的包被量为20～30μg抗体包被0.5～2mg磁珠。
4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述缓冲液包括甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液、柠檬酸铵缓冲液、乙酸铵+edta缓冲液或柠檬酸铵+edta缓冲液。
5.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述标记荧光基团和猝灭基团的寡核苷酸链底物的终浓度为2～20μm；所述甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液和柠檬酸铵缓冲液的...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛文文，康琳，李佳欣，柳婷婷，董理娜，高姗，王景林，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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